Aus dem Institut für Rechtsmedizin der Universität Würzburg
Vorstand: Prof. Dr. med. Christoph Meißner

DNA-analytische Untersuchungen an frischen und gelagerten Zähnen


Inaugural – Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Sebastian Gebhard
aus Schnaittach
Würzburg, Juli 2009
Referent: Prof. Dr. med. Dieter Patzelt
Korreferent: Prof. Dr. med. dent. Dipl.-Ing. Ernst-Jürgen Richter
Dekan: Prof. Dr. med. Matthias Frosch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.03.2010
Der Promovend ist Zahnarzt.

 


Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Forensische Zahnmedizin
1.2 Molekularbiologische Grundlagen
1.2.1 Der genetische Fingerabdruck
1.2.2 Identifikationsmöglichkeiten mittels DNA-Analyse
1.2.2.1 Variable number of tandem repeats (VNTR)
1.2.2.2 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP)
1.2.2.3 Short tandem repeats (STR)
1.2.2.4 Mitochondriale DNA (mtDNA)
1.2.2.5 Geschlechtsdifferenzierung mittels Amelogenin
1.3 Allgemeine zahnärztliche Grundlagen
1.4 Aufgabenstellung
2 Materialien und Methoden
2.1 Instrumente und Reagenzien
2.1.1 Allgemeine Verbrauchsmaterialien und Geräte
2.1.2 Zahnreinigung und Probenentnahme
2.1.3 DNA-Extraktion
2.1.4 PCR
2.1.5 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
2.1.6 Hochauflösende Kapillarelektrophorese:
2.2 Zahnproben und Lagerung
2.2.1 Zähne aus den Zahnarztpraxen Dr. Werner Gebhard und Dr. Lothar Gebhard
2.2.2 Zähne aus der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr. Hemmerich
2.2.3 Zähne der Naturhistorischen Gesellschaft Nürnberg
2.2.3.1 Zähne aus einer Ausgrabung in Katzwang
2.2.3.2 Zähne aus der Dietersberghöhle
2.2.4 Zähne aus Sektionsgut
2.3 Versuchsaufbauten
2.3.1 Frisch extrahierte Zähne
2.3.2 Im Erdboden vergrabene Zähne
2.3.3 In Wasser gelagerte Zähne
2.3.4 Der Sonnenstrahlung ausgesetzte Zähne
2.3.5 Zähne aus Sektionsgut
2.3.6 Starker Hitze ausgesetzte Zähne
2.3.7 Vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne
2.3.8 Zähne der Ausgrabung in Katzwang
2.3.9 Zähne aus der Dietersberghöhle
2.4 Methoden
2.4.1 Kontaminationsvermeidung
2.4.2 Probenentnahme
2.4.3 DNA-Extraktion
2.4.4 Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.4.4.1 STR SE33
2.4.4.2 AmpFlSTR® SGM Plus Kit
2.4.4.3 STR TPOX-vs
2.4.4.4 Mentype® NonaplexQS PCR Amplifikation Kit
2.4.5 Gelelektrophorese und Silberfärbung
2.4.6 Hochauflösende Kapillarelektrophorese
2.4.7 Quantifiler® Human DNA Quantification Kit
3 Ergebnisse
3.1 Frisch extrahierte Zähne
3.2 Im Erdboden vergrabene Zähne
3.3 In Wasser gelagerte Zähne
3.4 Der Sonnenstrahlung ausgesetzte Zähne
3.5 Zähne aus Sektionsgut
3.6 Starker Hitze ausgesetzte Zähne
3.7 Vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne
3.9 Zähne aus der Dietersberghöhle
4 Diskussion
4.1 Methoden
4.1.1 Probenentnahme
4.1.2 DNA-Extraktion
4.1.3 PCR
4.1.4 Real-Time-Quantitative-PCR (RTQ-PCR)
4.2 Komplikationen und PCR-Artefakte
4.2.1 „allelic dropout“
4.2.2 Falsche Geschlechtsangabe
4.2.3 Stotterbanden
4.3 Ergebnisse
4.3.1 Frisch extrahierte Zähne
4.3.2 Im Erdboden vergrabene Zähne
4.3.3 In Wasser gelagerte Zähne
4.3.4 Der Sonnenstrahlung ausgesetzte Zähne
4.3.5 Zähne aus Sektionsgut
4.3.6 Starker Hitze ausgesetzte Zähne
4.3.7 Vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne
4.3.8 Zähne der Ausgrabung in Katzwang
4.3.9 Zähne aus der Dietersberghöhle
4.4 DNA-Analyse bei archäologischen Skelettfunden
5 Zusammenfassung
6 Literaturverzeichnis


Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Längen der Analyseprodukte in Beziehung zur Fragmentlänge der
degradierten DNA (aus Hummel 2003, S. 28)
Abb. 2: Apicales delta und Markkanal (Sicher et al. 1928, S. 128)
Abb. 3: Der Eingang zur Dietersberghöhle
Abb. 4: Standort der im Erdreich vergrabenen Zähne
Abb. 5: Standort der in Wasser gelagerten Zähne
Abb. 6: Standort der der Sonnenstrahlung ausgesetzten Zähne
Abb. 7: Aufbewahrungsgefäß der fast 30 Jahre alten Zähne
Abb. 8: Schädel mit Probenzahn Nr. 40 mit Trepanationsbohrung
Abb. 9: Die drei Zähne aus der Dietersberghöhle (Proben 48-50)
Abb. 10: Zahn mit zirkulärer Rille vor Öffnung der Pulpa
Abb. 11: Probenentnahmeplatz
Abb. 12: Probenzahn nach dem Aufbrechen
Abb. 13: Polyacrylamidgel auf der Kühlplatte
Abb. 14: Angefärbtes Vorgel der Proben 51 und 52; links: der SE33, rehts: SGMMultiplex;
beide mit Leiter, Neutralprobe, Positiv- und Negativkontrolle
Abb. 15: Obere Grafik: Die Referenzallelleiter dieses Systems dient zum
Abgleich mit den Probenergebnissen. Mittlere Grafik: Ein nicht
eindeutig detektierbares Ergebnis. Die beiden Peaks der Probe 26
liegen zwar im Bereich der Allele 16 und 17, treten aber nur sehr
schwach vom Hintergrundrauschen hervor und werden daher mit einem
„?“ kenntlich gemacht. Untere Grafik: Bei Probe 47 ist eine eindeutige
Allelzuordnung möglich.
Abb. 16: Tief zerstörter Zahn der Probe Nr. 9
Abb. 17: Beispiel für ein Elektropherogramm des Mentype® NonaplexQS analysiert
am ABI PRISM® 310 Analyser mit rot markiertem DNA-Längenstandard
550 (ROX) (Biotype AG, Produktinformation Mentype®
NonaplexQS)
Abb. 18: Stotterbanden bei di- und tetranukleotiden STR-Amplifikationsprodukten
(aus Hummel 2003, S. 36)


Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Übersicht über das Ausgangsmaterial der Zahnarztpraxen Dr. Werner
Gebhard und Dr. Lothar Gebhard
Tab. 2: Übersicht über das Ausgangsmaterial der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr.
Hemmerich
Tab. 3: Übersicht über das Ausgangsmaterial der Ausgrabung bei Katzwang
Tab. 4: Übersicht über das Ausgangsmaterial aus der Dietersberghöhle
Tab. 5: Übersicht über das Ausgangsmaterial aus dem Sektionsgut des
Instituts für Rechtsmedizin Würzburg
Tab. 6: PCR-Ansatz für SE33
Tab. 7: PCR-Bedingungen für SE33
Tab. 8: Systeme des AmpFlSTR® SGM Plus® (nach Arbeitsanleitung
AmpFlSTR® SGM Plus®, Applied Biosystems)
Tab. 9: PCR-Ansatz für AmpFlSTR® SGM Plus® (nach Arbeitsanleitung
AmpFlSTR® SGM Plus®, Applied Biosystems)
Tab. 10: PCR-Bedingungen für AmpFlSTR® SGM Plus® (nach Arbeitsanleitung
AmpFlSTR® SGM Plus®, Applied Biosystems)
Tab. 11: PCR-Ansatz für TPOX-vs (Hellmann et al. 2001)
Tab. 12: PCR-Bedingungen für TPOX-vs (Hellmann et al. 2001)
Tab. 13: Systeme des Mentype® NonaplexQS (nach Arbeitsanleitung für Mentype®
NonaplexQS, Biotype® und Homepage Biotype AG)
Tab. 14: PCR-Ansatz für Mentype® NonaplexQS (nach Arbeitsanleitung für
Mentype® NonaplexQS, Biotype®)
Tab. 15: PCR-Bedingungen für Mentype® NonaplexQS (nach Arbeitsanleitung für
Mentype® NonaplexQS, Biotype®)
Tab. 16: Ansatz für die Kapillarelektrophorese
Tab. 17: Ansatz für Quantifiler® Human DNA Quantification Kit (nach Arbeitsanleitung
Quantifiler® Human DNA Quantification Kit, Applied Biosystems)
Tab. 18(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der frisch extrahierten Zähne
Tab. 18(b): TPOX-vs und Nonaplex der frisch extrahierten Zähne
Tab. 19(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der vergrabenen Zähne
Tab. 19(b): TPOX-vs und Nonaplex der vergrabenen Zähne
Tab. 20(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der in Wasser gelagerten Zähne
Tab. 20(b): TPOX-vs und Nonaplex der in Wasser gelagerten Zähne
Tab. 21(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der Sonnenstrahlung ausgesetzten
Zähne
Tab. 21(b): TPOX-vs und Nonaplex der Sonnenstrahlung ausgesetzten Zähne
Tab. 22(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der Zähne aus dem Sektionsgut
Tab. 22(b): TPOX-vs und Nonaplex der Zähne aus dem Sektionsgut
Tab. 23(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der starker Hitze ausgesetzten Zähne
Tab. 23(b): TPOX-vs und Nonaplex der starker Hitze ausgesetzten Zähne
Tab. 24: Quantifizierung, SE33 und SGM der vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierten
Zähne
Tab. 25(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der Zähne der Ausgrabung in
Katzwang
Tab. 25(b): TPOX-vs und Nonaplex der Zähne der Ausgrabung in Katzwang
Tab. 26: Quantifizierung, TPOX-vs und Nonaplex der Zähne aus der Dietersberghöhle


Abkürzungsverzeichnis
6-FAM: 6-Carboxy-Fluoresein
AKFOS: Arbeitskreis Forensische Odonto-Stomatologie
bp: Basenpaar
DNA: Desoxyribonukleinsäure
BSA: Bovine serum albumin
dNTP: Desoxynucleosidtriphosphat
HEX: 4,7,2´,4´,5´,7´-Hexachloro-6-Carboxy-Fluorescein
NaOCl: Natriumhypochlorit
NHG: Naturhistorische Gesellschaft Nürnberg
OK: Oberkiefer
PAGE: Polyacrylamidgelelektrophorese
PCR: Polymerasekettenreaktion
ROX: 6-Carboxy-X-Rodamin
RTQ-PCR: Real-Time-Quantitative-PCR
STR: short tandem repeats
UK: Unterkiefer
VNTR: variable number of tandem repeats
vs-STR: very short STR
WF: Wurzelkanalfüllung

 



1 Einleitung
1.1 Forensische Zahnmedizin
Die Mithilfe von Zahnärzten bei der Untersuchung von Zähnen zur Identifizierung ist
in der Rechtsmedizin nicht unüblich. So wurde im Jahre 1976 während der 102.
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde der
Arbeitskreis Forensische Odonto-Stomatologie (AKFOS) gegründet, der es sich zur
Aufgabe gemacht hat, „die forensischen Aspekte in der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
zu sichten und die wissenschaftlichen Interessen dieses Gebietes [...] zu
fördern“ (§3 der Satzung des AKFOS).
Ein forensisch tätiger Zahnarzt wird immer hinzugezogen, wenn andere Methoden
zur Identifizierung einer unbekannten Leiche nicht mehr realisiert werden können
oder erfolglos blieben. Eine solche Identifizierung ist in der Regel durch eine
Erhebung des Zahnstatus eines Toten oder durch einen Röntgenfilm und anschließendem
Abgleich mit den zahnärztlichen Unterlagen der in Frage kommenden
Person möglich. Nicht nur die Anzahl fehlender Zähne, gesetzter Implantate und Versorgung
mit Wurzelkanalbehandlungen und Füllungen, sondern auch deren Position
im Kiefer, deren Ausdehnung und die verwendeten Materialien machen ein
menschliches Gebiss so gut wie unverwechselbar. Die Versorgung mit festsitzenden
oder herausnehmbaren, prothetischen oder kieferorthopädischen Arbeiten (Kronen,
Brücken, Teleskop-, Modellguß-, Klammer-, Coverdentureprothesen, totale Prothesen,
Multibandapparaturen, Spangen, …), chirurgische Eingriffe (Wurzelspitzenresektionen,
Knochenaugmentationen, Sinuslifts, …), das Vorhandensein von überzähligen
oder verlagerten Zähnen und Veränderungen durch Alter oder pathologische
Vorgänge (Zahnkippungen, Atrophie der Kieferkämme, Zysten, …) erweitern
zudem die interindividuelle Variabilität (Wittacker et al. 1993, S. 9ff; Rötzscher 2003,
S. 1590ff).
Schwieriger wird es, wenn keine Restbezahnung mehr vorhanden ist. In einigen
Ländern ist es daher üblich, dass Prothesen mit Markierungen versehen werden, die
eine Identifizierungshilfe geben (Rötzscher 2000, S. 157f).
Aber nicht nur zur Identifizierung von Personen ist der forensisch tätige Zahnarzt in
der Lage. Auch eine Lebensaltersschätzung ist mit Zähnen möglich. Anhand der
Chronologie der Zahnentwicklung und des Zahnwachstums kann bei Kindern unter
14 Jahren das Alter mit einer Zuverlässigkeit von +/- 2 Jahren bestimmt werden.
Resorption der Milchzahnwurzeln, sowie Ausbildung und Verkalkung sind im
Röntgenbild gut darstellbare Merkmale.
Der Razemisierungsgrad von Asparginsäure eignet sich für jedes Alter als eine
präzise Möglichkeit der Altersschätzung. Wegen seines extrem bradytrophen Stoffwechsels
ist Dentin ein optimales Gewebe zur biochemischen Lebensalterbestimmung.
Asparginsäure tritt in zwei Formen auf: In einer L- sowie in einer
D-Form. Bei der Biosynthese menschlicher Proteine werden ausschließlich L-Aminosäuren
gebildet. Ab dem Zeitpunkt der Synthese kommt es zu spontanen, nicht
enzymatischen Umwandlungen in die D-Form. Diese In-vivo-Razemisierung lässt
sich im Zahndentin nach entsprechender Aufbereitung und Analyse nachweisen. Seit
1995 wird diese Methode in Deutschland auch bei lebenden Personen angewendet
(Ritz-Timme et al. 2003).
Extrahierte Zähne erlauben eine Altersabschätzung auch durch Transluzenzbestimmung
des Wurzeldentins (Bang et al. 1970).
Eine der bisher größten Herausforderungen für forensische Zahnärzte war sicherlich
die Tsunami-Katastrophe im Indischen Ozean im Dezember 2004. Wie Petju,
Schuller-Gotzburg oder Tan in ihren Studien darlegen, wurden alle deutschen Opfer
in Thailand durch zahnärztliche Unterlagen identifiziert. Probleme durch mangelnde
Unterlagen gab es jedoch bei der Identifizierung einheimischer Opfer (Petju et al.
2007; Schuller-Gotzburg et al. 2006; Tan 2005).
Aber nicht nur Naturkatastrophen wie Erdbeben, Überschwemmungen oder Vulkanausbrüche
fordern immer wieder den Einsatz forensischer Zahnärzte. Auch
Katastrophen wie das Zugunglück in Eschede, Schiffshavarien oder Flugzeugabstürze
machen deren Einsatz ebenso nötig. Terrorangriffe wie im September 2001
in den USA, erweitern ebenfalls das Einsatzgebiet der forensischen Zahnmedizin
(Glass 2005).
Das „Victorian Institute of Forensic Medicine“ im australischen Melbourne entwickelt
seit 1997 eine computergestützte Software, die automatisiert den Zahnstatus vergleichen
und auf Übereinstimmungen untersuchen kann. Dieses „Disaster And Victim
IDentification“-Programm (DAVID) wird seit 2005 in ein Web-basierendes Programm
umprogrammiert, welches dann schnell weltweit einsetzbar sein wird (Clement et al.
2006).
Besonders Zähne eignen sich oft sehr gut zur Erstellung des sogenannten genetischen
Fingerabdrucks, da sie sehr widerstandsfähig gegen äußere Einflüsse sind.
„Sie sind bei hochgradiger Gewebszerstörung wie bei Wasserlagerung, Fäulnis oder
Leichenbrand eine relativ zuverlässige Quelle ausreichend hochmolekularer DNA.
Die Zahnpulpa ist durch ihre Lokalisation gut vor Degradation und Kontamination
geschützt“ (Patzelt et al. 2003, S. 1045).
1.2 Molekularbiologische Grundlagen
1.2.1 Der genetische Fingerabdruck
Zur Identifikation von Personen ist in Europa seit Anfang des 20. Jahrhunderts der
„normale“ Fingerabdruck, das Daktylogramm, nicht mehr wegzudenken. Bei diesem
Verfahren macht man sich das individuelle Hautleistenmuster der Fingerbeere zu
Nutze (Siegmund-Schultze 2003).
1985 erkannte Jeffreys das Potential individualspezifischer repetitiver DNA als
Grundlage zur Identifizierung. Durch die Analyse dieser nicht kodierenden DNAAbschnitte
ist es möglich jedes Individuum mit einem einzigartigen, strichcodeähnlichen
Muster in Verbindung zu bringen. Dieses Verfahren wird als „genetischer
Fingerabdruck“ bezeichnet, da ähnlich wie beim Daktylogramm eine eindeutige
Individualzuordnung möglich ist. Einzige Ausnahme bilden hierbei eineiige Zwillinge.
Mit den damaligen Techniken war allerdings eine große Menge an hochmolekularer
DNA nötig (Jeffreys et al. 1985).
1.2.2 Identifikationsmöglichkeiten mittels DNA-Analyse
Durch das „Human Genome Project“ wurde herausgefunden, dass nur ca. 5 % des
menschlichen Genoms für die Codierung der Proteine verantwortlich sind. Die nicht
codierenden Abschnitte sind für eine Identifizierung insofern interessant, weil sie eine
interindividuelle Variabilität aufweisen. Verschiedene Arten von polymorphen DNA-
Strukturen sind mittlerweile bekannt, welche in der Spurensuche Anwendung finden
(Hummel 2003, S. 26f).
1.2.2.1 Variable number of tandem repeats (VNTR)
Anfangs wurden längere, so genannte VNTRs (Variable number of tandem repeats)
oder Minisatelliten für forensische Untersuchungen herangezogen. Diese repetitiven
DNA-Sequenzen bestehen aus 5-50 Wiederholungen von 20-70 bp langen
Segmenten. Folglich benötigt man hierfür hochmolekulare DNA. Spezielle Oligonukleotide,
so genannte Primer, legen den Startpunkt der Amplikation festlegen und
definieren somit, welcher Locus auf der DNA in der PCR vervielfältigt wird (Horn et
al. 1989).
1.2.2.2 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP)
Bei der RFLP-Analyse (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen) von PCRProdukten
wird doppelsträngige DNA durch Restriktionsenzyme, so genannte Endonukleasen,
verdaut und anschließend durch Elektrophorese aufgetrennt. Mit
speziellen Sonden können nun die entstandenen Banden markiert und sichtbar
gemacht werden. Dieses Bandenmuster ist bei jedem Individuum unterschiedlich und
kann ebenso zur Identifizierung herangezogen werden. Der Nachteil dieser Methode
besteht darin, dass eine große Menge hochmolekularer DNA vorhanden sein muss,
was die Verwendung in der Rechtsmedizin einschränkt (Hummel 2003, S. 126f).
1.2.2.3 Short tandem repeats (STR)
Ab dem Beginn der 90er Jahre lösten kürzere, polymorphe Strukturen die VNTRs ab.
Zur Analyse dieser Mikrosatelliten oder STRs (Short Tandem Repeats) genügten
nunmehr kürzere DNA-Fragmente und es konnte eine stärker degradierte DNA zur
Individualzuordnung genutzt werden. Die sich dabei wiederholende Kernsequenz ist
lediglich 2-6 bp groß, sodass die zu analysierenden Genorte nur 100-300 bp lang
sind (Hammond et al. 1994; Urquhart et al. 1995).
Mit der Entwicklung von neuen Primern konnten noch kleinere Zielfragmente erfasst
und somit noch stärker degradierte DNA verwendet werden. Dies war möglich, indem
die Annealingposition der Primer näher an die repetitive Sequenz gelegt werden
konnte. So gelang es bei den vs-STRs (very short STRs), die Allelgrößen auf unter
87 bp beim System TPOX, unter 86 bp beim System TH01 und unter 106 bp beim
System FES zu senken. Beim Vergleich des klassischen Systems mit dem vs-
System desselben Individuums ist eine Übereinstimmung der Allelnummern zu
erwarten (Hellmann et al. 2001).
Das folgende Schema stellt die Länge der Analyseprodukte in Beziehung zur
Fragmentlänge der degradierten DNA dar:
Abb. 1: Längen der Analyseprodukte in Beziehung
zur Fragmentlänge der degradierten DNA (aus
Hummel 2003, S. 28)
1.2.2.4 Mitochondriale DNA (mtDNA)
Im Gegensatz zu chromosomaler DNA, die zur einen Hälfte von der Mutter und zur
anderen Hälfte vom Vater vererbt wird, wird die mitochondriale DNA ausschließlich in
der maternalen Linie weitergegeben. Dies kommt daher, dass die Oozyte den
kompletten Satz Mitochondrien bereits beinhaltet und vom Spermium bei der
Befruchtung in der Regel keine weiteren hinzukommen. Alle Familienmitglieder der
mütterlichen Linie besitzen folglich die gleiche mtDNA-Sequenz (Hühne et al. 1999).
Innerhalb der ringförmigen mtDNA kommen die meisten Sequenzpolymorphismen in
der „d-loop control region“ vor, die sich vor allem aus den Regionen HVR I und II
(hypervariable region I und II) zusammensetzt. Mittels Sequenzanalyse von DNA
dieser Regionen eines unbekannten Menschen und Vergleich mit DNA von in Frage
kommenden Personen oder von deren mütterlichen Verwandten kann eine Identifikation
durchführt werden (Bär et al. 2000).
Neben der hohen Variabilität bietet die mtDNA Vorteile wie das Analysieren von Verwandtschaftsbeziehungen
der mütterlichen Linie und das Vorkommen einer hohen
Anzahl an Kopien von 103-104 pro Zelle (Geserick et al. 1998).
1.2.2.5 Geschlechtsdifferenzierung mittels Amelogenin
Das Amelogenin ist ein Protein, das bei der Schmelzbildung der Zähne eine Rolle
spielt. Es wird auf den beiden gonosomalen Chromosomen X und Y an den Stellen
Xp22.31-p22.1 und Yp11.2 codiert. Anfang der 90er Jahre wurde entdeckt, dass das
erste Intron dieses Gens auf dem X-Chromosom 6 bp kürzer ist und statt 112 bp nur
106 bp aufweist. Somit deutet eine Bande (106 bp) bei der Analyse auf ein
weibliches Geschlecht, zwei Banden (106 bp und 112 bp) auf ein männliches
Geschlecht hin (Mannucci et al. 1994).
1.3 Allgemeine zahnärztliche Grundlagen
Ein Mensch hat mit Weisheitszähnen insgesamt 32 bleibende Zähne, davon pro
Kieferquadrant zwei Schneidezähne (Inzisivi), einen Eckzahn (Caninus), zwei kleine
Backenzähne (Prämolaren) und drei große Mahlzähne (Molaren). Der grundlegende
anatomische Aufbau ist bei allen Zähnen gleich (Fischer 1935, S. 2).
Die Bezifferung der Zähne wurde bei dieser Arbeit nach dem von der Federation
Dentaire Internationale 1970 eingeführten, so genannten FDI-Schema durchgeführt.
Dieses Zahnschema mit zwei Ziffern setzt sich aus der Nummer des Quadranten und
dem von der Mitte aus fortlaufend nummerierten Zahn zusammen (Lehmann et al.
2002, S. 9).
Ein Zahn besteht aus drei Hartgeweben, dem Zahnbein (Dentinum), dem Zahnschmelz
(Enamelum) und dem Zahnzement (Cementum).
Das Dentin besteht aus einer organischen, kollagenreichen Grundsubstanz (etwa
70 %) und zur Härtung aus anorganischen Hydroxylapatitkristallen Ca5(PO4)3(OH)
(etwa 30 %). Anders als bei der Knochenbildung, bei der sich die Osteoblasten in
den Knochen einmauern, bleiben die Dentin bildenden Zellen, die Odontoblasten, am
Rand des Zahnbeines liegen und entsenden lediglich 1-3 μm dicke Fortsätze
(„Tomes-Fasern“) in die Zahnbeinröhrchen (Tubuli dentales).
Zum Schutz vor Abnutzung wird das Dentin vom härtesten menschlichen Gewebe,
dem Zahnschmelz, überzogen. Dieser besteht, ähnlich wie Knochen oder Dentin,
aus Hydroxylapatitkristallen, die in eine organische Grundsubstanz eingelagert sind.
Der organische Anteil beträgt weniger als 1 %. Die Schmelz bildenden Zellen, die
Ameloblasten, liegen dem Zahnschmelz außen auf und werden nach dem Zahndurchbruch
rasch abgekaut. Zahnschmelzdefekte sind daher nicht regenerationsfähig.
Der im Knochen eingebettete Anteil ist von einem dünnen Überzug aus knochenähnlichem
Zahnzement umgeben. Kräftige Bandzüge ziehen von ihm aus in den
Kieferknochen und verankern somit den Zahn in der Zahnhöhle, der Alveole (Lippert
2003, S. 601).
Im Zahninneren, dem Pulpenkavum, befindet sich ein nerven- und gefäßreiches
Gewebe, welches unter anderem aus undifferenzierten Zellen, Fibroblasten und
Odontoblasten besteht (Hellwig et al. 2003, S. 248).
Schon 1928 war bekannt, dass sich der Wurzelkanal nicht nur
verjüngt, um schließlich in der Wurzelspitze im Foramen
apicale auszumünden, sondern sich in der Regel kurz vor dem
Ausgang in mehrere Äste aufteilt und damit ein apikales Delta
bildet (siehe Abb. 2). Eine weitere Form der Nebenäste stellen
Markkanäle dar, die eine Seitenwand der Wurzel perforieren
können und an der Außenseite münden (Sicher et al. 1928,
S. 128f).
Jeder Zahn im Gebiss ist durch sein Wurzelmerkmal, Massenmerkmal, Winkelmerkmal
und andere Zahnmerkmale eindeutig seiner Position im Zahnbogen
zuortbar. Das Wurzelmerkmal ist definiert als die Abweichung der Wurzel nach distal
im Bezug zur Zahnachse. Das Massenmerkmal bedeutet, dass die Zähne mesial
massiger sind als distal. Das Winkelmerkmal sagt aus, dass von vestibulär gesehen
der Winkel der Schneidekante mit der Approximalfläche mesial spitzer ist als distal
(Lehmann et al. 2002, S. 13).
Abb. 2: Apicales delta
und Markkanal (Sicher
et al. 1928, S. 128)
In dieser Arbeit wurde Gewebe der Zahnpulpa untersucht. Das Zahnmarkgewebe ist
allerdings nicht immer gesund. In Folge von Karies entwickelt sich oftmals eine
Pulpitis. Dieses so veränderte Pulpengewebe unterliegt den für Entzündungen
üblichen Kardinalsymptomen Rubor, Tumor, Kalor, Dolor und Funktio laesa. Allerdings
verursacht die besondere Topografie charakteristische Verlausformen. Durch
einen Reiz ausgelöste Hyperämie führt zu einer Erhöhung des Gewebedrucks.
Daraufhin wandern Leukozyten durch chemokinetische und chemotaktische Faktoren
aus den Gefäßen an den Reaktionsort; eine reversible Pulpitis entsteht. Kann der
Reiz entfernt werden, kommt es zur Ausheilung. Bei weiterem Bestehen des Reizes
wandern kurzlebige neutrophile Granulozyten ein, welche beim Absterben
zelltoxische Komponenten und proteolytische Enzyme freisetzen, die bei entsprechender
Konzentration unweigerlich zur Pulpanekrose führen.
Neben der aseptischen, entzündungsbedingten Nekrose kann auch eine
Kolliquationsnekrose durch in die Pulpa eindringende Bakterien entstehen. Dabei
kann der bakterielle Befall entweder durch eine kariöse Läsion des Zahnhartgewebes
stattfinden oder die Bakterien gelangen retrograd durch eine Entzündung des Zahnhalteapparates
(Parodontitis) über das Foramen apicale in das Endodont (Paro-
Endo-Läsion) (Hellwig et al. 2003, S. 254ff).
Die Therapie einer Pulpitis besteht in einer Wurzelkanalbehandlung. Hierbei wird die
pulpitische oder gangränöse Kronen- und Wurzelpulpa entfernt, das Kanallumen mit
endodontischen Instrumenten aufbereitet und anschließend der Wurzelkanal mit
Spüllösungen und medizinischen Einlagen desinfiziert. Wenn die Kanäle (teils erst
nach mehreren Sitzungen) beschwerdefrei sind und trocken gelegt werden können,
werden die Wurzelkanäle mit Guttaperchastiften und einer Wurzelkanalfüllpaste verschlossen
(Weber 2003, S. 298ff).
Wegen der üblich verwendeten desinfizierenden Wurzelkanaleinlagen ist fraglich, ob
aus wurzelgefüllten Zähnen für die Analyse verwertbare DNA gewonnen werden
kann. Besonders durchgeführte Spülungen mit Natriumhypochlorit zur Reinigung der
Wurzelkanäle zerstören vorhandene DNA.
1.4 Aufgabenstellung
Zielsetzung dieser Doktorarbeit war zu überprüfen, inwieweit die Fortentwicklung
molekularer Nachweisverfahren der letzten Jahre neue Möglichkeiten zur
Typisierung von STR-Systemen an Zähnen bietet. Dabei wurde im Besonderen der
Frage nachgegangen, wie sich verschiedene Lagerungsbedingungen auf die
Degradation von pulpaler DNA auswirken. Hierzu wurden einige zum Zeitpunkt der
Zahnextraktion vitale Zähne im Erdreich vergraben, in Wasser gelagert, der Sonneneinstrahlung
ausgesetzt und im Wärmeschrank erhitzt. Zwei Zähne aus dem
Sektionsgut des Institutes für Rechtsmedizin der Universität Würzburg wurden ohne
spezielle Lagerung in dieser Arbeit verwendet. Zähne mit vorhandenen Wurzelkanalfüllungen
wurden auf verwertbare Ergebnisse hin analysiert. Zusätzlich standen vor
28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne sowie 380-550 Jahre und 2.300-2.800 Jahre
alte Zähne zur Untersuchung zur Verfügung.


2 Materialien und Methoden
2.1 Instrumente und Reagenzien
2.1.1 Allgemeine Verbrauchsmaterialien und Geräte
Gefrierschrank Premium Liebherr, Biberach
Kühlschrank Bosch, Stuttgart
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Safeguard-Filtertips 10, 30, 100, 200 und 1000 μl PeqLab, Erlangen
Vortex-Gerät Genie 2 Bender & Hobein, Zürich
Wärmeschrank Modell 600 Memmert, Schwabach
2.1.2 Zahnreinigung und Probenentnahme
K-Feile Colorinox® der Größen 20 - 55 Dentsply, Konstanz
Petrischale, steril Hartenstein, Würzburg
NaOCl Roth, Karlsruhe
Hebel nach Bein Aesculap, Tuttlingen
Prämolarenzange Aesculap, Tuttlingen
Diamantbohrer Komet, Lemgo
Turbine Kavo, Biberach
Einschweißfolien Hawo, Obringheim
Pinzette Carl Martin, Solingen
2.1.3 DNA-Extraktion
E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit PeqLab, Erlangen
Ethanol, absolut Roth, Karlsruhe
Wasserbad Modell B Lauda, Königshofen
Zentrifuge Microliter Hettich, Tuttlingen
Brutschrank B 30 Memmert, Schwabach
2.1.4 PCR
Microcon YM-30 Millipore, Eschborn
PCR-Wasser LiChrosolv® Merck, Darmstadt
Mineralöl Sigma, Steinheim
Thermocycler ABI Gene Amp PCR System 2400 Applied Biosystems, Weiterstadt
Thermocycler „Personal Cycler“ Biometra, Göttingen
Amplifikation mit dem „AmpFl STR ® SGM Plus“-Kit :
AmpliTaq Gold® (5 U/μl) Applied Biosystems, Weiterstadt
AmpF1STR® PCR Reaction Mix Applied Biosystems, Weiterstadt
AmpF1STR® Profiler Plus Primer Set Applied Biosystems, Weiterstadt
Amplifikation des SE33-Systems:
10x Taq Buffer Eppendorf, Hamburg
Nucleotide-Triphosphat (5 mM) Pharmacia, Freiburg
MgCl Soluion (2 mM) Applied Biosystems, Weiterstadt
Taq DNA Polymerase (5 U/μl) Eppendorf, Hamburg
Primer 1 und 2 (SE33) Applied Biosystems, Weiterstadt
Amplifikation mit dem Mentype ® Nonaplex QS PCR Amplifikation Kit :
JumpStartTM Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich, Steinheim
Reaction Mix A Biotype, Dresden
Primer Mix Biotype, Dresden
Amplifikation des TPOX-vs-Systems:
wie SE33-System
Primer 1 und 2 MWG-Biotech, Ebersdorf
Quantifiler ® Human DNA Quantification Ki t
Quantifiler® PCR Reaction Mix Applied Biosystems, Weiterstadt
Quantifiler® Human Primer Mix Applied Biosystems, Weiterstadt
T10E0.1 (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 0.1 mM Na2EDTA) Applied Biosystems, Weiterstadt
PRISM® 7000 Sequence Detection System Applied Biosystems, Weiterstadt
2.1.5 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
Niedrigauflösende horizontale Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE):
Ansatz für ein 5 % Polyacrylamidgel:
16 ml H2O
2,1 ml 10 x TBE-Puffer
2,7 ml Acrylamid/Bisacrylamidlösung
(Acrylamide-Bis 19:1) Serva, Heidelberg
200 μl APS Serva, Heidelberg
1,5 μl TEMED Serva, Heidelberg
Glasplatten 124 x 258 mm Glas Keil, Würzburg
Probenpuffer:
0,25 % Bromphenol Blau Roth, Karlsruhe
0,25 % Xylen Cyanol Roth, Karlsruhe
25 % Ficoll 400 Roth, Karlsruhe
10 x TBE-Puffer:
890 mM Tris-Borat Roth, Karlsruhe
25 mM EDTA (pH 8,0) Roth, Karlsruhe
Probenauftragsplättchen Serva, Heidelberg
Gene Ruler 100 bp Ladder Plus MBI Fermentas, Litauen
Salpetersäure 1 % Roth, Karlsruhe
Silbernitratlösung:
0,4 g AgNO3 Roth, Karlsruhe
200 ml Aqua dest.
Entwicklerlösung:
0,28 M NaH2CO3 Roth, Karlsruhe
0,019 % Formalin Roth, Karlsruhe
Essigsäure 10 % Roth, Karlsruhe
Glycerol Roth, Karlruhe
Elektrodenstreifen Serva, Heidelberg
Elektrophoresekammer LKB 2117 Multiphor II LKB/Pharmacia, Freiburg
Elektrophoresekühlgerät LKB 2219 Multitemp II LKB/Pharmacia, Freiburg
GelBond PAG-Film Pharmacia, Freiburg
Spannungsgerät LKB 2297 Macrodrive 5 LKB/Pharmacia, Freiburg
Taumelschüttler Polymax 2040 Heidolph, Schwabach
Folie für Gel Pharmacia, Freiburg
2.1.6 Hochauflösende Kapillarelektrophorese:
GeneScan 500 ROX Size Standard Applied Biosystems, Weiterstadt
Formamid Sigma, Steinheim
Genetic Analyzer ABI 310 Applied Biosystems, Weiterstadt
2.2 Zahnproben und Lagerung
Das Untersuchungsmaterial dieser Arbeit umfasst insgesamt 50 Zähne und zwei
Mulltupfer, die nach der Zahnextraktion zur Blutstillung verwendet wurden (Nr. 46
und 47). Zum größten Teil (39 Zähne) stammen diese Zähne aus den Zahnarztpraxen
von Dr. Werner Gebhard, Schnaittach, und Dr. Lothar Gebhard, Nürnberg.
Die Zähne Nr. 21 bis 23 stammen aus der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr. Hemmerich,
München. Die Zähne Nr. 38 bis 40 wurden von der Naturhistorischen Gesellschaft
Nürnberg (NHG) aus der Abteilung für Vorgeschichte von Dr. Mühldorfer aus einer
Ausgrabung in Katzwang bei Nürnberg für die Untersuchungen überlassen. Bei einer
Grabung in der Dietersberghöhle wurden die Zähne der Proben Nr. 48, 49 und 50
gefunden und ebenfalls von der NHG Nürnberg für diese Arbeit bereitgestellt. Aus
dem Sektionsgut des Institutes für Rechtsmedizin Würzburg wurden die Zähne
Nr. 33 und 34 entnommen.
Nach Beendigung des jeweiligen Versuches wurden die Zähne im Institut bei -20 °C
bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Die dabei stattfindende DNA-Degradation
wurde als vernachlässigbar eingestuft.
2.2.1 Zähne aus den Zahnarztpraxen Dr. Werner Gebhard und Dr. Lothar Gebhard
Von extrahierten Zähnen wurde Granulations- und Wurzelhautgewebe entfernt. Nach
Trocknung wurden diese in Einschweißfolie versiegelt und dem Verfasser übergeben.
Bis zur weiteren Verwendung wurden sie für kurze Zeit dunkel, trocken und kühl
gelagert.
Die Patienten wurden über die geplante Arbeit informiert und gaben dazu ihr Einverständnis.
Zeitpunkt der Extraktion, Alter und Geschlecht wurden anonym erfasst und
für die Arbeit verwendet.
Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über das Ausgangsmaterial von diesen
beiden Praxen wieder:
Probennr.
Alter des
Patienten Genus Zahn Extraktionstag Bemerkung
1 19 m 18 20.05.2005
2 84 m 42 30.05.2005 Zahn vital
3 54 m 12 03.06.2005 Zahn vital
4 69 m 31 02.06.2005 Zahn vital
5 69 m 42 02.06.2005 Zahn vital
6 80 w 23 06.06.2005 Zahn avital
7 74 w 26 05.07.2005 tief zerstört
8 51 m 23 17.05.2005 tief zerstört
9 51 m 25 17.05.2005 tief zerstört
10 64 w 36 15.06.2005
11 51 m 24 17.05.2005 tief zerstört
12 21 m 28 08.06.2005
13 21 m 38 08.06.2005
14 87 w 24 19.08.2005 stark sklerosiert
15 18 w 28 28.10.2003 weit offenes Foramn apicale
16 48 m 23 04.08.2005 Tupfer Nr. 47
17 79 w 42 06.06.2005
18 18 m 28 02.06.2005
19 83 w 13 15.06.2005
20 69 m 46 04.07.2005 Zahn vital
24 35 m 26 18.08.2005 WF am 02.08.04
25 57 m 26 19.05.2005 WF seit ~6 a
26 58 w 37 07.07.2005 Tupfer Nr. 46
27 51 m 18 30.07.2005
28 59 m 12 02.08.2005
29 57 w 38 22.07.2005 Zahn vital
30 55 m 34 02.08.2005
31 69 m 38 07.07.2005
32 49 m 38 08.07.2005 Zahn vital
35 38 m 28 25.08.2005
36 19 m 38 16.06.2005 Zahn vital
37 59 m 11 13.10.2005
41 53 w 41 22.09.2005 Zahn vital
42 44 w 17 04.10.2005 Zahn vital
43 44 w 48 17.06.2005 Zahn vital
44 19 m 28 16.06.2005 Zahn vital
45 69 m 36 07.07.2005 Zahn vital
51 23 w 38 06.11.2006 Zahn vital
52 45 w 48 27.12.2006
Tab. 1: Übersicht über das Ausgangsmaterial der Zahnarztpraxen Dr. Werner Gebhard und Dr. Lothar
Gebhard
2.2.2 Zähne aus der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr. Hemmerich
Die Zähne aus der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr. Hemmerich, München, stammen aus
einer Sammlung von Zähnen mit anormalen Wurzelverhältnissen, die Dr. Werner
Gebhard in den Jahren 1977/78 während seiner Assistenzzeit entfernt hat. Sie sind
folglich vor 28 bzw. 29 Jahren gezogen worden. Nach der Zahnextraktion wurden sie
gereinigt und mit H2O2 gebleicht. Anschließend lagerten sie bei Raumtemperatur
trocken in einem gläsernen Behältnis (siehe Abb. 7, S. 22). Das Alter und Geschlecht
der Patienten konnte nach einer so langen Zeitspanne nicht mehr festgestellt
werden. Die Stellung im Zahnbogen wurde anhand von Kronenform, Kronenflucht,
Krümmungsmerkmal und Winkelmerkmal (siehe Kapitel 1.3, S. 7) zugeordnet. Die
Zähne waren vollständig erhalten und ohne kariöse Läsionen (siehe Tab. 2).
Probennr. Alter des Patienten Genus Zahn Extraktionsjahr Bemerkung
21 ? ? 23 1976/77
22 ? ? 48 1976/77
23 ? ? 23 1976/77
Tab. 2: Übersicht über das Ausgangsmaterial der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr. Hemmerich
2.2.3 Zähne der Naturhistorischen Gesellschaft Nürnberg
Insgesamt sechs Zähne aus zwei Zeitepochen wurden von der Naturhistorischen
Gesellschaft Nürnberg (NHG) für Untersuchungszwecke zur Verfügung gestellt.
Diese waren im Rahmen von zwei archäologischen Grabungen geborgen und von
der NHG bereits wissenschaftlich bearbeitet worden.
Zwei Zähne waren noch im Kieferknochen verankert und ihre Stellung im Zahnbogen
konnte so eindeutig identifiziert werden. Die anderen vier Zähne lagen als Einzelzähne
vor und konnten anhand von typischen Zahnmerkmalen, wie bereits in Kapitel
1.3, S. 7 beschrieben, der Stellung im Zahnbogen zugeordnet werden.
2.2.3.1 Zähne aus einer Ausgrabung in Katzwang
Drei Zähne stammen aus einer Ausgrabung des Jahres 2004 an der Friedhofs- und
Wehrmauer der Kirche „Unserer Lieben Frauen“ in Katzwang im Süden Nürnbergs.
Die dazugehörigen Skelette wurden außerhalb der Friedhofsmauer etwa 70 cm
unterhalb der jetzigen Grasoberfläche entdeckt. Insgesamt wurden Skelettteile von
13 Individuen gefunden, wobei davon auszugehen ist, dass es sich hierbei um eine
größere Grablege handeln muss. Die menschlichen Leichname wurden nach
christlicher Sitte in Ost-West-Richtung und mit gekreuzten Armen beigesetzt. An
diversen Knochen konnten Verletzungen durch Hieb- und Stichwaffen nachgewiese
werden. Derzeit wird angenommen, dass die Knochen aus einem der folgenden drei
Kriege stammen müssten:
- 1. Markgrafenkrieg (1449/50)
- 2. Markgrafenkrieg (1552-54)
- Dreißigjähriger Krieg (besonders 1631/32).
Folglich kommt ein Alter der Knochenfunde von etwa 380-550 Jahren in Betracht.
Eine Radiocarbonuntersuchung zur genaueren Datierung steht noch aus, ist aber
nach einer geplanten anthropologischen Untersuchung vorgesehen (Zeitler 2005).
In der folgenden Tabelle ist eine Übersicht über dieses Ausgangsmaterial aufgelistet:
Probennr.
Alter des
Leichnams Genus Zahn Grabungsjahr Bemerkung
38 ? ? 18 2004 Einzelzahn
39 ? ? 17 oder 18 2004 Einzelzahn
40 ? ? 16 2004 Zahn im Kiefer
Tab. 3: Übersicht über das Ausgangsmaterial der Ausgrabung bei Katzwang
2.2.3.2 Zähne aus der Dietersberghöhle
Drei weitere untersuchte Einzelzähne, ebenfalls
aus dem Bestand der NHG Nürnberg, stammen
aus einer Grabung des Archäologen J. R. Erl in der
Dietersberghöhle bei Egloffstein. Neben zahlreichen
Schädel- und Skelettfragmenten von
erwachsenen Personen, Kleinkindern und Föten
befanden sich auch 44 lose Zähne (Erl 1953,
S. 238).
Die Höhle ist eine 11 m tiefe Schachtspalte mit
einem etwa 1,5 m x 1,0 m großen Einstiegsloch
(siehe Abb. 3). Der Schuttkegel am Boden der
Höhle bestand aus humosem Sediment, welches
bei Regen stark durchnässt wurde.
Diese Höhle diente wahrscheinlich als Begräbnisstätte eines Familienverbandes
(epigenetische Merkmale weisen auf familiäre Verhältnisse hin) von Wald und
Abb. 3: Der Eingang zur Dietersberghöhle
Wildimkern aus der späten Hallstattzeit (HaC und HaD) und der frühen La-Tène-Zeit,
beides Epochen der Eisenzeit. Dies konnte aus Grabbeigaben und Schmuckstücken
geschlossen werden. Das Alter der Zähne beträgt somit 2.300-2.800 Jahre.
Forensisch-anthropologische Untersuchungen haben ergeben, dass sich Reste von
mindestens 46 Individuen in der Höhle befunden haben. Unter der Hauptinventarnummer
8289 werden sie in der Sammlung der NHG aufbewahrt (Baum 1999).
Die genauen Lagerbedingungen der Ausgrabungsreste können nicht mehr ermittelt
werden, da während der Kriegsjahre die Sammlungsstücke zum Schutz vor
Plünderungen mehrmals ausgelagert wurden. Bis zum Umzug der NHG im Jahre
2000 lagerten die Präparate schließlich auf dem Dachboden und waren dort ständig
wechselnder Temperatur und Luftfeuchtigkeit ausgesetzt. Erst danach konnten die
Kellerräume der Norishalle zum Aufbewahren herangezogen werden (Mühldorfer).
Da sehr viele der ausgegrabenen Zähne tiefe kariöse Läsionen aufwiesen (der
Kariesbefall lag bei 33,5 %), wurden drei äußerlich unversehrte Zähne für diese
Untersuchung herangezogen. Bei erfolgreichem Erstellen eines genetischen Fingerabdruckes
wären verwandtschaftliche Beziehungen und das Geschlecht der
Individuen von großer archäologischer Bedeutung. Die NHG wäre dann an weiteren
Untersuchungen interessiert gewesen.
In der nachfolgenden Tabelle sind Informationen über die Zähne aus der Dietersberghöhle
zusammengefasst:
Probennr. Alter des
Leichnams Genus Zahn Grabungsjahr Bemerkung
48 ? ? 11 1928 Einzelzahn
49 ? ? 23 1928 Einzelzahn
50 ? ? 18 1928 Einzelzahn
Tab. 4: Übersicht über das Ausgangsmaterial aus der Dietersberghöhle
2.2.4 Zähne aus Sektionsgut
In zwei Fällen konnten Zähne von Leichen mit Liegezeiten von 14 bis 17 Tagen aus
dem Sektionsgut des Instituts für Rechtsmedizin Würzburg zur Untersuchung herangezogen
werden.
Probenzahn Nr. 33 wurde am 30.08.05, Probenzahn Nr. 34 am 31.08.05 aus den
Leichnamen extrahiert. Bis zur weiteren Aufarbeitung wurden die Zähne in sterilen
Röhrchen bei -20 °C im institutseigenen Gefrierschrank aufbewahrt.
Tabelle 5 gibt Auskunft über dieses Ausgangsmaterial:
Probennr. Alter des Verstorbenen Genus Zahn Liegezeit Obduktionstag Bemerkung
33 36 m 33 ~17d 25.08.2005
34 59 m 33 ~14d 31.08.2005
Tab. 5: Übersicht über das Ausgangsmaterial aus dem Sektionsgut des Instituts für Rechtsmedizin
Würzburg
2.3 Versuchsaufbauten
2.3.1 Frisch extrahierte Zähne
Um mit den Gerätschaften und den Reagenzien vertraut zu werden und um zu überprüfen,
ob das E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit für diese Analyseaufgabe geeignet ist,
wurden einige Zähne ohne Lagerung DNA-analytisch untersucht. Weiterhin wurden
asensible Zähne, Zähne mit obliteriertem Pulpenkavum, Weisheitszähne mit weit
offenem Foramen apicale und Zähne mit großen kariösen Läsionen oder Wurzelkanalbehandlungen
analysiert.
Diese Zähne wurden keiner gesonderten Lagerung unterzogen, sondern direkt ausgewertet.
Bis zur Auswertung wurden sie, wie auch alle anderen Zähne, bei -20 °C
im Gefrierschrank aufbewahrt.
2.3.2 Im Erdboden vergrabene Zähne
Bei dieser Versuchsanordnung wurden Einmalplastikbecher
am Boden mit Löchern versehen und mit
Folienstift beschriftet. Diese Becher wurden verwendet,
um die Zähne wieder finden und identifizieren zu
können. Die Löcher dienten dazu, dass sich nach
Regenfällen kein Wasser in den Becher stauen
konnte. Jeder Becher wurde zu einem Drittel mit Erde
gefüllt, dann ein Zahn platziert und darauf wiederum Erde bis zum Becherrand aufge-
Abb. 4: Standort der im Erdreich
vergrabenen Zähne
schüttet. Anschließend wurden die Becher an einer relativ feuchten und schattigen
Stelle unter Büschen bis zur Oberkante vergraben. Die Zähne lagen somit etwa 4 cm
unter der Erde und waren den Witterungsbedingungen ausgesetzt (siehe Abb. 4,
S. 19).
Für die Untersuchungen wurden Zähne nach etwa vier Wochen (Zahn 10), etwa vier
Monaten (Zahn 26), etwa einem halben Jahr (Zähne 31 und 32) und etwa einem Jahr
(Zähne 43, 44 und 45) Liegezeit entnommen.
2.3.3 In Wasser gelagerte Zähne
Die fünf in Wasser gelagerten Zähne (Nr. 35, 41, 42,
36 und 37) wurden in kleine, mit Leitungswasser
gefüllte Glasgefäße gegeben. Die Deckel wurden
nicht verschraubt, sondern nur aufgelegt, um einen
Gasaustausch zu ermöglichen (siehe Abb. 5). Regelmäßig
wurde der Wasserstand überprüft und bei
Bedarf Wasser nachgefüllt. Diese Versuchsreihe
lagerte im Heizungskeller bei Temperaturen um die 20 °C.
Entnommen wurden Zähne nach etwa einem Vierteljahr (Zahn 35), einem halben
Jahr (Zähne 41 und 42) und einem Jahr (Zähne 36 und 37).
2.3.4 Der Sonnenstrahlung ausgesetzte Zähne
Um den Einfluss der Sonnenstrahlung auf die DNA in
Zähnen zu bewerten, wurden die Probenzähne 51,
52, 27, 28, 29 und 30 der Sonnenstrahlung
ausgesetzt. Hierzu wurden wieder Einmalplastikbecher
am Boden mit Löchern versehen, um Regenwasser
eine Abflussmöglichkeit zu bieten. Damit die
Zähne möglichst ohne Schatten der Sonne ausgesetzt
waren und um die Becher stabil zu verankern,
wurden sie etwa zu zwei Drittel mit kleinen Kieselsteinen aufgefüllt und obenauf die
Abb. 5: Standort der in Wasser
gelagerten Zähne
Abb. 6: Standort der der Sonnenstrahlung
ausgesetzten Zähne
Probenzähne gelegt. Anschließend wurden die Becher auf einem Garagendach bis
zum Becherrand in ein Kiesbett versenkt. Somit konnten die Zähne nicht vom Wind
weggeblasen werden und sie waren den Witterungsbedingungen, insbesondere der
UV-Strahlung der Sonne, ausgesetzt (Abb. 6, S. 20).
Entnommen wurden Zähne nach etwa vier Wochen (Zähne 51 und 52), vier Monaten
(27 und 28) und einem halben Jahr (Zähne 29 und 30) Liegezeit.
2.3.5 Zähne aus Sektionsgut
Wie schon in Kapitel 2.2.4, S. 18 beschrieben, stammen zwei Zähne (Nr. 33 und 34)
von Sektionen im Institut für Rechtsmedizin Würzburg.
Dabei wurde der Zahn der Probe 33 einer stark verwesten Leiche eines 36-jährigen
Mannes entnommen, bei der laut Obduktionsbericht eine Liegezeit von etwa 17
Tagen angenommen wird. Es waren bereits schwärzlich-grüne Verfärbungen der
Haut festzustellen. Kopf- und Gesichtsweichteile fehlten vollständig. Ausgedehnter
Madenbefall war bereits zu erkennen.
Die Probe 34 stammt vom Leichnam eines 59-jährigen Mannes mit höchstgradiger
Fäulnis und teilweise beginnender Mumifizierung. Die Haut war schwärzlich verfärbt.
Im Bereich des Mittelgesichts lag das Knochengerüst vollständig frei und massiver
Madenbefall war feststellbar. Die Liegezeit betrug laut Obduktionsbericht etwa 14
Tage.
2.3.6 Starker Hitze ausgesetzte Zähne
Dieser Versuch diente dazu zu erforschen, wie stark DNA im Zahn unter sehr heißen
Bedingungen, wie sie beispielsweise bei Bränden entstehen können, degradiert.
Hierzu wurden die Zähne Nr. 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19 und 20 in einem feuerfesten
Glasbehälter in einen auf 200 °C vorgeheizten Ofen im Institut für Rechtsmedizin
gegeben.
Nach 30 min (Zähne 11 und 12), 60 min (Zähne 13 und 16), 90 min (Zähne 17 und
18) und 120 min (Zähne 19 und 20) wurden die Zähne wieder entnommen und auf
Raumtemperatur abgekühlt.
2.3.7 Vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne
Die Zähne, welche aus der Kieferchirurgiepraxis Dr. Dr.
Hemmerich aus München stammen, waren vor 28 bzw. 29
Jahren entfernt worden. Die Lagerung der mit H2O2
gereinigten Zähne erfolgte trocken in einem Glasbehältnis
bei Raumtemperatur und ohne direkte Sonneneinstrahlung
(siehe Abb. 7).
2.3.8 Zähne der Ausgrabung in Katzwang
Wie bereits in Kapitel 2.2.3.1, S. 16 beschrieben,
stammen diese Zähne von einer Ausgrabung in
Katzwang. Um so viel Zahnsubstanz wie möglich zu
erhalten, wurden diese Zähne entgegen dem üblichen
Prozedere nicht zirkulär geschwächt und aufgebrochen,
sondern von okklusal trepaniert. Um auch diese
Bohrung möglichst klein zu halten, wurde nur die
große palatinale Wurzel (alle diese Zähne waren OK
Molaren) zugänglich gemacht und für die Untersuchung genutzt (siehe Abb. 8).
2.3.9 Zähne aus der Dietersberghöhle
Die Einzelzähne der Ausgrabung „Dietersberghöhle“ (siehe Abb. 9) wurden nur mit
dem System TPOX-vs und dem Nonaplex-Multiplex analysiert, da auf Grund ihres Alters
wenig DNA zu erwarten war. Auch hier wurde kein Zahn zirkulär geschwächt
und durchgebrochen, sondern wie bei den Zähnen der Ausgrabung in Katzwang
durch Bohrungen von palatinal (Probenzähne 48 und 49) bzw. okklusal (Probenzahn
50) eröffnet.
Abb. 7: Aufbewahrungsgefäß
der fast 30 Jahre
alten Zähne
Abb. 8: Schädel mit Probenzahn
Nr. 40 mit Trepanationsbohrung
2.4 Methoden
2.4.1 Kontaminationsvermeidung
Eine Kontamination der Zähne, wie auch der entnommenen
Proben, mit Fremdmaterial muss vermieden
werden, um eine erfolgreiche DNA-Analyse zu erhalten.
Zum einen kann dadurch Fremd-DNA in die Versuchsreihen
gelangen und falsche Resultate liefern,
zum anderen kann das Verunreinigen der Proben mit
Bakterien oder DNA-abbauenden Enzymen zur
Degradation der DNA und somit zu falsch-negativen
Ergebnissen führen. Während der gesamten Aufbereitung und Verarbeitung ist eine
Kontamination mit fremdem Material möglich. Besonders zu erwähnende Kontaminationsquellen
sind neben der Methode zur Entnahme der Probe, die Labormitarbeiter,
die Laborausstattung, die Pipetten, die Pipettenspitzen, die Reaktionsgefäße, die
Reagenzien, die Zentrifugenröhrchen, der Thermocycler und die Elekrophoresekammer,
um nur einige Beispiele zu nennen (Newton et al. 1994, S. 53ff).
Zur Vermeidung einer Kontamination wurden diverse Vorkehrungen
getroffen. Damit nur Material aus dem Inneren
des Zahns in den Versuch gelangte, wurden die Zähne
sowohl vor Anlage einer zirkulären Rille mit einer Zahnarztturbine
(siehe Abb. 10), als auch vor dem Aufbrechen im
Labor von außen sorgfältig mit einem in NaOCl-getränkten
Tuch gereinigt. NaOCl bewirkt hierbei eine Oxidation der
außen noch anhaftenden DNA-Überreste, wodurch diese
denaturiert und somit zerstört werden. Um eine Kreuzkontamination
mit der vorherigen Probe zu unterbinden,
wurden sämtliche Instrumente wie der Hebel nach Bein, Zange, Pinzette und Endofeilen
nach jedem Gebrauch in NaOCl eingelegt und anschließend mit einem neuen
Stück Papierrolle getrocknet (Gilbert et al. 2005; Yang et al. 2003).
Des Weiteren wurde als Unterlage im Labor bei jeder Probe ein frisches Stück
Papiertuch ausgebreitet. Dieses musste nicht steril sein, da das Probenmaterial damit
nicht direkt in Kontakt kam. Die Proben wurden ausschließlich über einer sterilen
Abb. 10: Zahn mit zirkulärer
Rille vor Öffnung der Pulpa
Abb. 9: Die drei Zähne aus der
Dietersberghöhle (Proben 48-50)
Petrischale aus dem Zahn entnommen. Dies fand bei jeder Probe mit neuen Latexhandschuhen
statt.
Sämtliche Pipettenspitzen, welche nicht vom Hersteller steril verpackt angeliefert
werden, wurden vor Benutzung im Autoklaven sterilisiert.
Zur Überprüfung auf das Vorhandensein von kontaminierten Reagenzien lief von
Beginn an bei jeder Versuchsreihe eine Neutralprobe mit. Zusätzlich diente eine
Negativkontrolle bei der PCR zur weiteren Sicherheit.
Im Rahmen der Vorbereitung der PCR wurden weitere Vorsichtsmaßnahmen
getroffen. So wurde der Platz zum Herstellen des Mastermix und zum Verteilen auf
die PCR-Röhrchen strikt von dem Platz der Zugabe der DNA getrennt, um eine
„carry over“-Kontamination zu unterbinden.
Ständiges Tragen von frischen Einmalhandschuhen beim Pipettieren der Reagenzien
war obligat.
Nachdem das Ergebnis der Proben vorlag, konnte auch durch Vergleich mit den bekannten
genetischen Fingerabdrücken des Verfassers und der übrigen Labormitarbeiter
eine weitere Kontaminationsquelle ausgeschlossen werden.
2.4.2 Probenentnahme
Die Zähne wurden vor der Bearbeitung zunächst, wie
in Kapitel 2.4.1, S. 23 beschrieben, mit einem NaOCl
getränktem Lappen abgerieben, um eventuell anhaftende
DNA-Reste zu entfernen. Anschließend wurden
die Zähne in der Zahnarztpraxis Dr. Gebhard,
Schnaittach, mit einem Diamantbohrer und einer
Zahnarztturbine auf Höhe der Schmelz-Zement-Grenze
durch das Anlegen einer Rille zirkulär geschwächt,
in Einschweißfolie versiegelt und erst im Institut unter
Laborbedingungen aufgebrochen, sodass nun die eröffnete Pulpa und die Wurzelkanäle
zugänglich waren. So wurde eine Kontamination während des Transports
ausgeschlossen.
Die Abbildung 11 zeigt den Arbeitsplatz im Institut für Rechtsmedizin, an dem die
Probeentnahme aus den eröffneten Zähnen stattfand.
Abb. 11: Probenentnahmeplatz
Mit einer Zahnextraktionszange und einem Bein’schen
Hebel wurden die Zähne an den vorher angelegten
Sollbruchstellen aufgebrochen (siehe Abb. 12). Falls
noch intaktes Pulpagewebe vorhanden war, wurde
dieses mit einer feinen Pinzette entnommen und in ein
beschriftetes Zentrifugenröhrchen überführt. Danach
wurden die Wurzelkanäle mit Endofeilen aufsteigender
Größe aufbereitet und die dabei gewonnenen Dentinspäne
in einer Petrischale gesammelt.
2.4.3 DNA-Extraktion
Aus den so gewonnen Proben erfolgte die DNA-Gewinnung mittels „E.Z.N.A.® Tissue
DNA Mini Kit“ der Firma PeqLab. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem
die DNA selektiv und reversibel an eine Silikamembran gebunden wird.
Das Vorgehen entspricht der dem Kit beiliegenden Arbeitsanleitung. Hierzu werden
mit Hilfe von 200 μl TL-Puffer die Späne aus der Petrischale in ein steriles, 1,5 ml
fassendes Zentrifugenröhrchen gegeben, mit 25 μl OBTM-Proteinase versetzt, durch
Vortexen sorgfältig gemischt und für drei Stunden in 55 °C warmes Wasser gegeben.
Da kein Schüttelwasserbad zur Verfügung stand, wurden, wie ebenfalls laut
Anleitung möglich, die Proben alle 30 min durch Vortexen gemischt, um eine Sedimentierung
zu verhindern. Bei den Proben 1, 2, 7 bis 10 und 26 bis 35 wurde die
Inkubation über Nacht im Brutschrank bei 37 °C durchgeführt, was im Isolierungsprotokoll
ebenso angegeben ist. Dieser Schritt dient dem Aufschließen der Zelle und
dem Abbau von Proteinen.
Anschließend wird dem Lysat 220 μl BL-Puffer hinzupipettiert, durch Vortexen
gemischt und bei 70 °C im Wasserbad zehn Minuten inkubiert.
Nach Zugabe von 220 μl absolutem Ethanol und Vortexen wird der gesamte Ansatz
auf eine HiBind®-DNA-Säule geladen und bei 8.000 g für eine Minute abzentrifugiert.
Dabei binden die Nukleinsäuren reversibel an der Silikamembran der HiBind®- Säule.
Der Durchfluss wird verworfen.
Durch zweimaliges Waschen mit jeweils 600 μl DNA-Waschpuffer, welcher bereits
mit dem 1,5-fachen Volumen mit absoluten Ethanol ergänzt worden war, und
Abb. 12: Probenzahn nach dem
Aufbrechen
Abzentrifugieren für eine Minute bei 8.000 g werden störende PCR-Hemmstoffe entfernt.
Das Zentrifugat wird jeweils verworfen.
Nun wird die Membran bei maximaler Geschwindigkeit der Zentrifuge (ca. 12.000 g)
für zwei Minuten vollständig getrocknet.
Bei der folgenden Elution werden 200 μl auf 70 °C vorgewärmter Elutionspuffer auf
die in ein frisches Zentrifugenröhrchen gesteckte Säulenmatrix pipettiert, bei Raumtemperatur
drei Minuten inkubiert und bei 8.000 g für eine Minute abzentrifugiert. Um
eine höhere DNA-Konzentration zu erlangen, wurde für die zweite Elution das erste
ebenfalls auf 70 °C vorgewärmte Eluat verwendet (Arbeitsanleitung PeqLab).
2.4.4 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR stellt eine in vitro-Technik dar, mit der man DNA-Abschnitte vervielfältigen
kann. Dazu muss lediglich die Anfangs- und Endsequenz dieses Abschnittes bekannt
sein. Die doppelstränige DNA wird bei 94 °C aufgeschmolzen (Denaturierung), damit
sie einzel-strängig vorliegt. Oligonucleotidprimer, die zu den Anfangs- und Endabschnitten
komplementär sind, lagern sich an die DNA Matrize (template) an. Dieser
Vorgang wird als Annealing bezeichnet und benötigt eine Temperatur zwischen 50
°C und 65 °C je nach Primer. Die DNA-Polymerase lagert vom Primer in 5’-Richtung
Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs) entsprechend der einzelsträngigen DNAMatrize
an. Diese Synthese der neuen DNA-Stränge wird Extension genannt und
findet polymeraseabhängig zwischen 68 °C und 72 °C statt. MgCl2 und ein
zugesetzter Puffer sind ebenfalls für die PCR essentiell. MgCl2 fördert in einer
Konzentration zwischen 1,0 mM und 1,5 mM die Polymeraseaktivität, kann aber bei
zu hoher Konzentration inhibierend wirken Der Puffer schafft das richtige pH-Milieu
für die Reaktionen. Mit der nun folgenden erneuten Denaturierung beginnt der zweite
Zyklus. Dies führt zu einem exponentiellen Anstieg der Zielsequenz. Die Zyklenanzahl
ist je nach verwendetem PCR-Kit unterschiedlich. Sind alle Zyklen durchlaufen,
schließt sich ein abschließender 45-minütiger Extensionsschritt an, bei dem
unvollständig amplifizierte DNA-Stränge noch aufgefüllt werden. Schließlich kühlt der
Thermocycler die Proben auf 4 °C herab (Newton et al. 1994, S. 19ff).
Von jeder Probe wurde eine PCR-Reaktion mit 1 μl, 5 μl bzw. 10 μl DNA angesetzt
und mit sterilem Aqua dest. auf ein Volumen von 25 μl ergänzt. Die PCR wurde in
den automatischen Thermocyclern ABI Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems)
und Personal Cycler (Biometra) durchgeführt. Zur Aktivierung der DNAPolymerase
wurden die Proben vor dem ersten PCR-Zyklus auf 94 °C erhitzt.
2.4.4.1 STR SE33
Zur Amplifizierung des STR-Einzelsystems SE33 werden zwei Primersequenzen
benötigt, die sich wie folgt zusammensetzten:
Primer 1: 5’-AATCTGGGCGACAAGAGTGA-3’
Primer 2: 5’-ACATCTCCCCTACCGCTATA-3’
(Möller et al. 1994)
Die nachfolgenden Tabellen 6 und 7 geben die Zusammensetzung des Mastermix
und die Bedingungen der PCR wieder:
Reagens Menge
Primer 1: 0,75 μl/Ansatz
Primer 2: 0,75 μl/Ansatz
dNTP: 1,00 μl/Ansatz
10 x Puffer: 2,50 μl/Ansatz
MgCl2 2,00 μl/Ansatz
Taq DNA Polymerase: 0,20 μl/Ansatz
Gesamt: 7,20 μl/Ansatz
Tab. 6: PCR-Ansatz für SE33
Phase Temperatur Dauer
Aktivierung der Taq DNA Polymerase : 94 °C 10 min
Denaturierung: 94 °C 1 min
Annealing: 60 °C 1 min
Extension: 72 °C 1 min
abschließende Extension: 60 °C 45 min
Kühlung: 4 °C ¥
35 Zyklen
Tab. 7: PCR-Bedingungen für SE33
2.4.4.2 AmpFlSTR® SGM Plus Kit
Der Multiplex AmpFlSTR® SGM Plus beinhaltet 11 x 2 fluoreszenzmarkierte Primer,
durch welche die STR-Loci D3S1358, vWA, D19S539, D2S1338, D8S1179, D21S11,
D18S51, D19S433, THO1 und FGA, sowie die erste Intronsequenz des Amelogenin-
Gens amplifiziert werden. Mit Hilfe dieses Segments des Amelogenin-Gens ist eine
Geschlechtsdifferenzierung möglich (siehe Kapitel 1.2.2.5, S. 6).
In Tabelle 8 sind die Systeme des AmpFlSTR® SGM Plus Kits aufgelistet:
Locus Chromosomaler
Ort
Repetitives Motiv Größe in
bp
Fluoreszentzmarkierung
D3S1358 3p TCTA [TCTG]1-2 [TCTA]n 114-142 5-FAM
vWA 12p12-pter TCTA [TCTG]3-4 [TCTA]n 157-209 5-FAM
D16S539 16q24-qter [AGAT]n 234-274 5-FAM
D2S1338 2q35-37.1 [TGCC]n [TTCC]n 289-341 5-FAM
Amelogenin X: p22.1-22.3 107 JOE
Amelogenin Y: p11.2 113 JOE
D8S1179 8 [TATR]n; R kann A oder C sein 128-172 JOE
D21S11 21q11.2-q21
[TCTA]n [TCTG]n [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA
[TCTA]2 TCCATA [TCTA]n
187-243 JOE
D18S51 18q21.3 [AGAA]n 26-345 JOE
D19S433 19q12-13.1 [AAGG] [AAAG] [AAGG] [TAGG] [AAGG]n 106-140 NED
THO1 11p15.5 [TCAT]n 165-204 NED
FGA 4q28 [TTTC]3 TTTTTTCT [CTTT]n CTCC [TTCC]2 215-353 NED
Tab. 8: Systeme des AmpFlSTR® SGM Plus® (nach Arbeitsanleitung AmpFlSTR® SGM Plus®, Applied
Biosystems)
Das AmpFlSTR® SGM Plus Kit beinhaltet bereits den AmpFlSTR® PCR Reaction Mix,
das AmpFlSTR® Profiler Plus Primer Set und die AmpliTaq Gold® DNA Polymerase
(5 U/μl). Der AmpFlSTR® PCR Reaction Mix ist ein Gemisch aus einem dNTP-Mix,
Mg2+ und BSA (Bovine serum albumin). Das beigesetzte BSA kann PCR-inhibierende
Einflüsse minimieren, indem es die Inhibitoren bindet (Comey et al. 1994).
Die beiden folgenden Tabellen 9 und 10 geben die Zusammensetzung des Mastermix
und die bei der PCR herrschenden Bedingungen wieder:
Reagens Menge
ABI AmpFlSTR® Profiler Plus Primer Set: 2,50 μl/Ansatz
ABI AmpFlSTR® PCR Reaction Mix: 5,00 μl/Ansatz
AmpliTaq Gold® DNA Polymerase: 0,50 μl/Ansatz
Gesamt: 7,50 μl/Ansatz
Tab. 9: PCR-Ansatz für AmpFlSTR® SGM Plus® (nach Arbeitsanleitung AmpFlSTR® SGM Plus®, Applied
Biosystems)
Phase Temperatur Dauer
Aktivierung der AmpliTaq GoldTM DNA Polymerase: 94 °C 1 min
Denaturierung: 94 °C 1 min
Annealing: 59 °C 1 min
Extension: 72 °C 1 min
abschließende Extension: 60 °C 45 min
Kühlung: 4 °C ¥
28 Zyklen
Tab. 10: PCR-Bedingungen für AmpFlSTR® SGM Plus® (nach Arbeitsanleitung AmpFlSTR® SGM
Plus®, Applied Biosystems)
2.4.4.3 STR TPOX-vs
Wie das STR-System SE33 (siehe Kapitel 2.4.4.1; S. 27) ist das STR-System TPOXvs
ein einzelnes System, das durch die beiden folgenden Primersequenzen bestimmt
wird:
Primer 1: 5’-CCTGTTCCTCCCTTATTTCC-3’
Primer 2: 5’-GAACACAGACTCCATGGTG-3’
Durch neue Primer verkürzt sich der zu amplifizierende Abschnitt von 218-246 bp
(TPOX) auf 58-86 bp (TPOX-vs) (Hellmann et al. 2001).
Der Mastermix für die PCR-Ansätze setzt sich wie in Tabelle 11 aufgelistet
zusammen. In Tabelle 12 ist das Programm zur Amplifizierung im Thermocycler aufgeführt:
Reagens Menge
Primer 1: 0,75 μl/Ansatz
Primer 2: 0,75 μl/Ansatz
dNTP: 1,00 μl/Ansatz
10 x Puffer: 2,50 μl/Ansatz
MgCl2 2,00 μl/Ansatz
Taq DNA Polymerase: 0,20 μl/Ansatz
Gesamt: 7,20 μl/Ansatz
Tab. 11: PCR-Ansatz für TPOX-vs (Hellmann et al. 2001)
Phase Temperatur Dauer
Aktivierung der Taq DNA Polymerase: 94 °C 10 min
Denaturierung: 94 °C 1 min
Annealing: 55 °C 1 min
Extension: 72 °C 1 min
abschließende Extension: 60 °C 45 min
Kühlung: 4 °C ¥
35 Zyklen
Tab. 12: PCR-Bedingungen für TPOX-vs (Hellmann et al. 2001)
2.4.4.4 Mentype® NonaplexQS PCR Amplifikation Kit
Das Mentype® NonaplexQS PCR Amplification Kit beinhaltet die Loci D3S1358,
D8S1179, D18S51, D21S11, FGA, SE33, THO1 und vWA. Zusätzlich wird wiederum
die erste Intronsequenz des Amelogenin amplifiziert.
Tabelle 13 gibt eine Übersicht über die im Mentype® NonaplexQS verwendeten Systeme:
Locus
Chromosomaler
Ort Repetitives Motiv
Referenzallel
Größe in
bp
Fluoreszentzmarkierung
Amelogenin Xp22.1-22.3 83 6-FAM
Amelogenin Yp11.2 87 6-FAM
D8S1179 8q23.1-23.2 [TATC]12 12 95-163 6-FAM
D21S11 21q21.1
[TCTA]4 [TCTG]6 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2
TCCATA [TCTA]11
29 177-252 6-FAM
D18S51 18q11.1 [AGAA]13 13 281-427 6-FAM
THO1 11p15.5 [TCAT]9 9 82-131 HEX
D3S1358 3p25.3 TCTA [TCTG]2 [TCTA]15 18 139-195.5 HEX
SE33 6q14.2 [AAAG]9 AA [AAAG]16 25.2 196-377 HEX
vWA 12p13.31 TCTA [TCTG]4 [TCTA]13 18 102-168 NED
FGA 4q28.2 [TTTC]3 TTTTTTCT [CTTT]13 CTCC [TTCC]2 21 174-338 NED
Tab. 13: Systeme des Mentype® NonaplexQS (nach Arbeitsanleitung für Mentype® NonaplexQS, Biotype
® und Homepage Biotype AG)
Der Lieferumfang dieses Kits beinhaltet ein Reaktionsgemisch (Reactions Mix A),
welches Mg2+, dNTP-Mix und BSA bereits enthält, und ein Primergemisch (Primer
Mix). Zusätzlich wird noch die JumpStartTM Taq DNA Polymerase (Sigma; 2,5 U/μl)
benötigt, welche vor der PCR bei 94 °C für eine Minute aktiviert werden muss.
Die beiden folgenden Tabellen zeigen die Zusammensetzung des Mastermix für den
PCR-Ansatz, sowie den PCR-Ablauf:
Reagens Menge
Primer Mix: 2,50 μl/Ansatz
Reaction Mix A: 5,00 μl/Ansatz
JumpStartTM Taq DNA Polymerase: 0,40 μl/Ansatz
Gesamt: 7,40 μl/Ansatz
Tab. 14: PCR-Ansatz für Mentype® NonaplexQS (nach Arbeitsanleitung für Mentype® NonaplexQS, Biotype
®)
Phase Temperatur Dauer
Aktivierung der JumpStartTM Taq DNA Poymerase: 94 °C 1 min
Denaturierung: 94 °C 1 min
Annealing: 60 °C 1 min
Extension: 72 °C 1 min
abschließende Extension: 68 °C 45 min
Kühlung: 4 °C ¥
35 Zyklen
Tab. 15: PCR-Bedingungen für Mentype® NonaplexQS (nach Arbeitsanleitung für Mentype® NonaplexQS,
Biotype®)
2.4.5 Gelelektrophorese und Silberfärbung
Bei der Gelelektrophorese lassen sich Proteine,
Nukleinsäuren oder andere geladene Makromoleküle
im elektrischen Feld nach ihrer Größe, Form und
Nettoladung trennen. Zur Auftrennung von DNAMolekülen
kleiner 500 Nukleotide eignet sich besonders
die PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese),
weil sie entgegen dem Agarosegel sehr kleine Poren
aufweist. Da die DNA negative Ladung trägt, wandert
sie in einem elektrischen Feld zur Anode. Als
Ergebnis entstehen Banden von gleich weit gewanderten
Molekülen (siehe Abb. 13) (Kreutzig 2002, S.
117).
Nach Abschluss der Elektrophorese wurden die
Elektrodenstreifen entfernt und das Gel in eine Glasschale
gegeben. Zur Äquilibrierung wurde dem Gel
1%-ige Salpetersäure (HNO3) zugegeben und es
wurde für fünf Minuten auf einen Taumelschüttler
gestellt. Anschließend wurde das Gel etwa zehn
Abb. 13: Polyacrylamidgel auf der
Kühlplatte
Abb. 14: Angefärbtes Vorgel der
Proben 51 und 52; links: der SE33,
rehts: SGM-Multiplex; beide mit
Leiter, Neutralprobe, Positiv- und
Negativkontrolle
Sekunden mit Aqua dest. abgespült und mit frisch angesetzter Silbernitrat-Lösung für
zwölf Minuten auf dem Schüttler inkubiert. Nach erneutem gründlichem Spülen mit
Aqua dest. wurde die Entwicklerlösung zugegeben und bis zum Sichtbarwerden der
PCR-Banden abgewartet. Zum Stoppen des Entwicklerprozesses diente eine 10%-
ige Essiglösung, welche mindestens zwei Minuten einwirken musste. Um die Gele
lagerfähig zu machen, wurden sie mit Aqua dest. gründlich gespült, für fünf Minuten
in 5%-iges Glycerol eingelegt und schließlich nach einer Nacht bei 80 °C im Wärmeschrank
mit Folie bedeckt (siehe Abb. 14, S. 31) (Allen et al. 1989).
2.4.6 Hochauflösende Kapillarelektrophorese
Mit Hilfe kapillarelektrophoretischer Auftrennung (GeneScan) im automatischen
Sequenzierautomaten Genetic Analyzer ABI 310 (Applied Biosystems) ist es
möglich, die STR-Systeme zu analysieren. In einer mit Polymer gefüllten Kapillare
erfolgt hierbei die Elektrophorese (Ziegle et al. 1992).
Dabei ist es möglich, die Fragmentlänge bis auf ein Basenpaar genau zu bestimmen.
Dies wird nach lasergestützter Fragmentlängenmessung durch einen Vergleich mit
einem internen Längenstandard (GeneScan 500 ROX Size Standard, Applied
Biosystems) ermöglicht. Die fluoreszierenden Marker dienen der Differenzierung
überlappender Systeme (Kimpton et al. 1993). Eine parallel aufgetrennte Allelleiter
dient der Zuordnung der Fragmentlängen zu einem definierten Allel.
In der folgenden Tabelle finden sich die entsprechenden Mengen der Reagenzien
wieder:
Reagens Menge
Formamid: 12,00 μl/Ansatz
GeneScan 500 ROX Size Standard: 0,50 μl/Ansatz
Gesamt: 12,50 μl/Ansatz
Tab. 16: Ansatz für die Kapillarelektrophorese
Nachdem der Mastermix auf die Probengefäße verteilt worden war, wurde das zu
analysierende PCR-Produkt in Abhängigkeit von der Intensität der Banden dem
PAGE-Gel (zwischen 0,5 und 3,0 μl) hinzu gegeben. Zur Linearisierung der DNA
wurden die Ansätze bei 95 °C für 150 Sekunden im Heizblock inkubiert und
anschließend im Sequenzierautomaten analysiert.
2.4.7 Quantifiler ® Human DNA Quantification Ki t
Mittels des Quantifiler® Human DNA Quantification Kit und dem PRISM® 7000
Sequence Detection System ist es möglich DNA-Konzentrationen zu bestimmen.
Dabei wird mit einer Real-Time-Quantitative-PCR (RTQ-PCR) ein 62 bp langes
Intron des Human telomerase reverse transcriptase Gens (hTERT) amplifiziert. Diese
Zielsequenz befindet sich bei 5p15.33. Der Quantifiler® Human Primer Mix besteht
aus den beiden Primern mit Fluoreszenzmarkierung (FAM). Im Quantifiler® PCR
Reaction Mix sind bereits die AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, dNTPs und ein
Puffer enthalten. Zusätzlich muss noch eine Verdünnungsreihe aus acht Standards
angefertigt werden, die zum späteren Vergleichen dient. Hierzu werden 10 μl des
Quantifiler Human DNA Standards (200 ng/μl) mit 30 μl T10E0.1 (10 mM Tris-HCl [pH
8.0], 0.1 mM Na2EDTA) verdünnt. Vom Standard 1 (50 ng/μl) werden wiederum 10 μl
mit 30μl T10E0.1 vermischt bis bei Standard 8 eine Konzentration von 0,023 ng/μl
vorliegt.
Die Tabelle zeigt die Zusammensetzung des Mastermix, der zu den 2 μl DNA zugegeben
werden muss.
Reagens Menge
Quantifiler® Human Primer Mix: 10,50 μl/Ansatz
Quantifiler® PCR Reaction Mix: 12,50 μl/Ansatz
Gesamt: 23,00 μl/Ansatz
Tab. 17: Ansatz für Quantifiler® Human DNA Quantification Kit (nach Arbeitsanleitung Quantifiler® Human
DNA Quantification Kit, Applied Biosystems)
Bei der RTQ-PCR werden die Proben durch Fluoreszenz-Messungen im Bereich von
500-660 nm analysiert und durch einen Vergleich mit den Standards ausgewertet
(Arbeitsanleitung Quantifiler® Human DNA Quantification Kit, Applied Biosystems).
Durch die mitlaufende Neutralprobe kann überprüft werden, ob Geräte und
Reagenzien DNA-frei waren.


3 Ergebnisse
Das Probengut umfasste 50 Zähne. Diese wurden verschiedenen Lagerbedingungen
ausgesetzt und überprüft, ob daraufhin noch eine DNA-Analyse durchgeführt werden
konnte oder ob schon zu stark degradierende Einflüsse eingewirkt haben.
Nach der DNA-Extraktion wurden die Ansätze zunächst mit Hilfe des Systems SE33
und des SGM-Multiplex-Kits amplifiziert und ausgewertet. Konnte bei der Auswertung
keine eindeutige Typisierung vorgenommen werden, wurden die Proben mit weiteren
Kits amplifiziert. In Fällen, in denen das STR-System SE33 nicht detektierbar war,
wurde versucht, mit Hilfe des STR TPOX-vs, welcher nur sehr kurze DNA-Fragmente
zur Analyse benötigt, eine Typisierung zu erlangen. So sollte festgestellt werden, ob
überhaupt amplifizierbare DNA vorhanden ist. Falls die Typisierung mit dem STRSystem
SE33 erfolgreich war, aber mit dem SGM das Ergebnis nicht zufriedenstellend
ausfiel, wurde versucht, mit dem sensitiveren Nonaplex doch noch DNAanalytische
Untersuchungen zu bekommen. Ebenso wurde bei detektierbarem
TPOX-vs die DNA anschließend mit dem Nonaplex-Kit amplifiziert.
Zum Schluss wurden sämtliche DNA-Proben mit Hilfe des Quantifiler® Human DNA
Quantification Kits (Applied Biosystems) einer Quantifizierung unterzogen.
Das Ergebnis wurde als erfolgreich typisierbar angenommen, wenn sich der Peak bei
der GeneScan-Auswertung hinreichend groß (größer als 30 rfu [relative fluorescent
units]) auf einem Allelbereich dargestellt hat. Alle anderen Peaks, welche sich nur
schwach aus dem Rauschen erhoben haben (kleiner als 30 rfu), aber dennoch
deutlich auf einem Allelbereich lagen, wurden durch ein Fragezeichen „(?)“ kenntlich
gemacht (siehe Abb. 15, S. 35). Konnte kein Allel bestimmt werden, wurde dies
durch „*** “ markiert.
Die Probennummer wurde nach der Reihenfolge der bearbeiteten Zähne vergeben.
3.1 Frisch extrahierte Zähne
Die Proben 1 bis 5 stammen von Zähnen, welche vor der Zahnextraktion noch
sensibel auf einen Kältetest reagiert hatten. Ihre Zahnpulpen waren somit zum
Zeitpunkt der Entfernung noch vital. Mit den Systemen SE33 und SGM-Multiplex
waren diese Zähne erfolgreich detektierbar. Die gewonnen DNA-Konzentrationen
lagen dabei zwischen 0,374 und 15,4 ng/μl.
Der Zahn der Probe 6 reagierte vor der Zahnextraktion nicht mehr sensibel DNA war
mit dem Quantifiler nicht mehr nachweisbar. Die Systeme SE33 und der SGMMultiplex
ergab kein amplifizierbares Ergebnis. Das System TPOX-vs lieferte
Abb. 15: Obere Grafik: Die Referenzallelleiter dieses Systems dient zum Abgleich mit den
Probenergebnissen. Mittlere Grafik: Ein nicht eindeutig detektierbares Ergebnis. Die beiden Peaks
der Probe 26 liegen zwar im Bereich der Allele 16 und 17, treten aber nur sehr schwach vom
Hintergrundrauschen hervor und werden daher mit einem „?“ kenntlich gemacht. Untere Grafik: Bei
Probe 47 ist eine eindeutige Allelzuordnung möglich.
ebenso wie der Nonaplex-Multiplex ein vollständiges, eindeutig detektierbares
Merkmalsmuster, lediglich der Locus D8S1179 wurde als fraglich eingestuft.
Bei den Proben 7 bis 9 handelt es sich um Material
von tief kariösen Zähnen (siehe Abb. 16). Die Karies
war bereits soweit fortgeschritten, dass große Teile
der Krone fehlten. Mit einer Sonde konnte noch keine
direkte Verbindung zur Pulpa festgestellt werden, da
sich die Zahnpulpa an dieser Stelle bereits zurückgezogen
und Reizdentin gebildet hatte. Damit versucht
sich der Körper gegen die eindringenden Mikroorganismen zur Wehr zu setzten. Im
Zahn wird dabei lediglich eine reversible Pulpitis erzeugt, welche keine degradierenden
Eigenschaften aufweist. Die Systeme SE33 und der Nonaplex-Multiplex konnten
in allen Loci typisiert werden. Die DNA-Konzentrationen lagen zwischen 0,092 und
0,335 ng/μl.
Die Probe 14 wurde aus einem Zahn entnommen, bei dem das Pulpenkavum stark
obliteriert war und die Kanäle nur mit Mühe gefunden und aufbereitet werden
konnten. Mit sehr feinen Endonadeln der ISO-Größe 10 (0,1 mm Durchmesser an
der Spitze) war es möglich, den Kanal zu finden und schließlich bis ISO-Größe 30
aufzubereiten. Hierbei konnten nur das STR-System SE33 und der Locus TH01 des
Nonaplex-Multiplex ein Ergebnis aufzeigen. Die SGM-Multiplex-Analyse war, wie die
Konzentrationsbestimmung, erfolglos.
Bei Probe 15, die aus einem Weisheitszahn gewonnen wurde, war das Wurzelwachstum
noch nicht vollständig abgeschlossen. Trotz weit offener apikaler
Foramina konnte problemlos eine DNA-Analyse mittels SGM und SE33 gewonnen
werden. Die DNA-Konzentration betrug 11,42 ng/μl.
Zusätzlich konnten noch zwei Zähne mit Wurzelkanalfüllungen (Proben 24 und 25)
untersucht werden (siehe Kapitel 1.3, S. 8). Die DNA-Menge lag zwar mit < 5 pg/μl
unter der Nachweisgrenze, aber dennoch konnten bei Probe 24 (mit einer ein Jahr
alten Wurzelkanalfüllung) das System SE33 und fünf Loci des Nonaplex-Multiplex
(FGA, TH01, D3S1358, vWA und AMEL) erfolgreich amplifiziert werden. Die Analyse
des Multiplex SGM war in keinem System erfolgreich. Der Zahn der Probe 25 hatte
eine sechs Jahre alte Wurzelkanalfüllung. Das System SE33 zeigte keinen Erfolg,
wohingegen das System TPOX-vs und ein Locus des Nonaplex-Multiplex (TH01)
Erfolg brachten. Bei zwei Loci des SGM (D18S51 und vWA) und einem Locus des
Abb. 16: Tief zerstörter Zahn der
Probe Nr. 9
Nonaplex-Multiplex (D18S51) konnten Allele vermutet werden. Allerdings war der
Locus D18S51 bei den beiden Kits, AmpFl STR® SGM Plus und NonaplexQS PCR
Amplifikation, nicht übereinstimmend. Das Quantifiler® Human DNA Quantification Kit
konnte keine DNA nachweisen (siehe Tab. 18(a) und 18(b)).
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
1 15,4 26,2/27,2 21/22 13/14 15/17 7/9 15/16 28/29 16 17/18 11 24/25 XY
2 0,374 25,2/26,2 21/23 14/15,2 14/20 5/9,3 10/16 28/30 16/18 14/17 12/13 22/24 XY
3 5,21 14/21,2 19/25 15/15,2 14 7/9,3 12/13 29/31,2 16/18 14/16 11/12 17/19 XY
4 7,26 15/17 21 13 15/17 6/7 14/15 27/33,2 17 17 11/12 20/23 XY
5 7,11 15/17 21 13 15/17 6/7 14/15 27/33,2 17 17 11/12 20/23 XY
6 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** X
7 0,126 20/20,2 20/22 14/15 14/17 9,3 13/14 30/31,2 15/16 14/17 9/11 21/24 X
8 0,335 19/29,2 20/27 13/14 16/19 8/9,3 14 30/31,2 14/15 17/18 9/12 23/24 XY
9 0,092 19/29,2 20/27 13/14 16/19 8/9,3 14 30/31,2 14/15 17/18 9/12 23/24 XY
14 < 5pg 17,2 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
15 11,42 28,2/29,2 19/21 13/15 12/17 6/9 13/14 28/30 14/16 16/18 12 18/24 X
24 < 5pg 16/23,2 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
25 < 5pg *** *** *** 10,2 (?) *** *** *** *** 15,2 (?) *** *** ***
SE33 SGM
Tab. 18(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der frisch extrahierten Zähne
Probennr.
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
1 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch
2 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch; vital
3 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch; vital
4 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch; vital
5 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch; vital
6 8/9 15/28.2 20/25 12/20 9.3 12/14(?) 28/31.2 16 16/17 X frisch; avital
7 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch; tief zerstört
8 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch, tief zerstört
9 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch, tief zerstört
14 SE33 erfolgreich *** *** *** 9 *** *** *** *** *** frisch; 83J; stark sklerosiert
15 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war frisch; weit offenes F.a.
24 SE33 erfolgreich *** 20 *** 8/10 *** *** 17 16 XY frisch; 1 Jahre alte WF
25 8 *** *** 13 (?) 8/9.3 *** *** *** *** *** frisch; 6 Jahre alte WF
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 18(b): TPOX-vs und Nonaplex der frisch extrahierten Zähne
3.2 Im Erdboden vergrabene Zähne
Die vier Wochen im Erdreich vergrabene Probe 10 erbrachte ein vollständiges
Merkmalsmuster bei dem STR-System SE33 und dem SGM-Multiplex. Die Menge an
DNA von 0,019 ng/μl war hierfür ausreichend.
Nach drei Monaten (Probe 26) war schon eine leichte Degradation der DNA
eingetreten. Im Gegensatz zum System SE33 lieferte der SGM-Multiplex ein
unvollständiges Merkmalsmuster. Die Systeme D19S433, D3S1358 und AMEL
konnten eindeutig typisiert werden, bei den Loci FGA, TH01, D8S1179, D21S11,
vWA, D16S539 und D2S1338 waren die Peaks nur sehr schwach ausgeprägt. Der
Locus D18S51 ergab kein verwertbares Ergebnis. Die beim SGM-Multiplex potenziell
erkennbaren Loci konnten im Nonaplex-Multiplex komplett bestätigt werden.
Lediglich beim Locus FGA wurde im SGM-Multiplex nur ein Allel vermutet und im
Nonaplex-Multiplex wurden zwei Allele nachgewiesen. Die vorhandene DNA-Konzentration
betrug 0,042 ng/μl.
Proben 31 und 32 stammen von Zähnen, welche etwa ein halbes Jahr vergraben
waren. Bei beiden war der STR SE33 erfolgreich, jedoch war der SGM-Multiplex-
Ansatz nicht mehr für ein vollständiges Merkmalsmuster ausreichend. Lediglich bei
der Probe 31 konnten vier Loci (D19S433, D21S11, D16S539 und AMEL) bzw. bei
der Probe 32 acht Loci (FGA, D18S51, D8S1179, D21S11, D3S1358, vWA,
D16S539 und AMEL) des SGM-Multiplex teilweise detektiert werden. Die DNA-analytischen
Untersuchungen ergaben bei Probe 31 beim SGM-Multiplexlocus D21S11
ein Allelmuster mit zwei Peaks, von denen im Nonaplex nur eines bestätigt werden
konnte. Ebenso ergab sich bei Probe 31 beim SGM-Multiplex ein falsches
Geschlecht; das Allel für „Y“ wurde nicht amplifiziert. Locus D8S1179 der Probe 31
konnte auch mittels Nonaplex-Multiplex nicht ermittelt werden.
Nach etwa einem Jahr wurden die Probenzähne 43, 44 und 45 aus dem Erdreich
entnommen. Bei diesen Proben konnten nur noch vereinzelt Allele identifiziert
werden. Lediglich der sehr kurze TPOX-vs und der Locus AMEL des Nonaplex
konnten noch bei allen dreien erfolgreich amplifiziert werden. Bei Probe 43 war
daneben noch Locus TH01 des Nonaplex-Multiplex erfolgreich, bei Probe 44 der
Locus SE33 des Nonaplex-Multiplex und bei Probe 45 die Loci TH01 und D8S1179
des Nonaplex-Multiplex. Die Menge an DNA lag bei allen unter der Nachweisgrenze
von 5 pg/μl.
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
10 0,019 15/30,2 23/25 13/15 12/19 7/9,3 10/13 28/30 18 14/16 11 18/23 X
26 0,042 20/30,2 22 (?) 13/15,2 *** 7/9 (?) 11/13 (?)28/32,2 (?) 17/18 16/17 (?) 12/13 (?) 23 (?) X
31 < 5pg 19 *** 14 (?) *** *** *** 19/34,2 (?) *** *** 9 *** X
32 0,051 14/19 25(?) *** 14 *** 14 29 15/16 16/17 11/12(?) *** XY
43 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
44 < 5pg 17 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
45 < 10pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SE33 SGM
Tab. 19(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der vergrabenen Zähne
Probennr.
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
10 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war Erde: 09.07.-15.08.05
26 SE33 erfolgreich 20/30.2 18/22 15/17 7/9 11/13 28/32.2 17/18 16/17 X Erde: 09.07.-15.10.05
31 SE33 erfolgreich 19 19 19 6 *** 34.2 15/17 *** XY Erde: 09.07.05-03.03.06
32 SE33 erfolgreich 14/19 25 14 7/10 14 29 15/16 16/17 XY Erde: 09.07.05-03.01.06; vital
43 8/11 *** *** *** 6 *** *** *** *** X Erde: 09.07.05-24.07.06; vital
44 11 *** *** *** *** *** *** *** *** X Erde: 09.07.05-24.07.06; vital
45 8/11 *** *** *** 6 13/14 *** *** 15 XY Erde: 09.07.05-24.07.06; vital
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 19(b): TPOX-vs und Nonaplex der vergrabenen Zähne
3.3 In Wasser gelagerte Zähne
Bei der Analyse konnte aus der vier Wochen im Wasser gelagerten Probe 35 nur
0,078 ng/μl DNA gewonnen werden. Zwar reichte dies aus, um mittels des Systems
SE33 und dem Nonaplex-Multiplex eine DNA-Analyse zu erreichen, allerdings konnte
der SGM-Multiplex nicht an allen Loci eindeutig typisiert werden. Die fünf erfolgreich
amplifizierten und die drei vermuteten Loci des SGM-Multiplex stimmten zwar mit
denen des Nonaplex-Multiplex überein, jedoch konnten die Loci D8S1179, D16S539
und D2S1338 im SGM-Multiplex nicht wiedergegeben werden.
Die ein halbes Jahr in Wasser gelegenen Proben 42 (0,511 ng/μl DNA) und 43
(0,666 ng/μl DNA) waren mit dem Einzelsystem SE33 und dem SGM-Multiplex
typisierbar, sodass die PCR weder mit dem System TPOX-vs noch mit dem
Nonaplex-Multiplex durchgeführt werden musste.
Nach einem Jahr waren die Ergebnisse weniger erfolgreich. Das Quantifizierungskit
konnte keine DNA mehr nachweisen. Bei Probe 36 waren die Systeme SE33 und
TPOX-vs erfolgreich, aber sowohl beim SGM-Multiplex, wie auch beim Nonaplex-
Multiplex traten nur etwa die Hälfte der Systeme zum Vorschein. Erfolgreich waren
beim SGM-Multiplex die Loci FGA, TH01, D8S1179, D21S11, D3S1358, vWA und
AMEL, beim Nonaplex-Multiplex die Loci D18S51, TH01, D21S11, D3S1358, vWA
und AMEL. Bei Probe 37 war weder mit dem System SE33 noch dem SGM-Multiplex
eine Typisierung möglich, jedoch lieferte das System TPOX-vs ein erfolgreich
typisiertes Ergebnis. Auch der Nonaplex-Multiplex ergab an den Loci TH01, D21S11,
D3S1358, vWA und AMEL einen verwertbaren Erfolg.
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
35 0,078 23,2/26,2 20/22 15(?) 12/16 7/9 *** 28/30(?) 15/16(?) 15/17 *** *** XY
41 0,511 13/32,2 24/25 13/14 12/15 7/9.3 13/14 30/31 16/17 15/18 11/12 18 X
42 0,666 18/30,2 21/26 13/15 12 6/10 13 27/30 15/17 14 13 20 X
36 < 5pg 17/29,2 17/18/19/24 *** *** 6/9 14 32,2/34,2 15 15 *** *** XY
37 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SE33 SGM
Tab. 20(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der in Wasser gelagerten Zähne
Probennr.
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
35 SE33 erfolgreich23.2/26.2 20/22 12/16 7/9 12/15 28/30 15/16 15/17 XY H2O: 23.09.05-03.01.06
41 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war H2O: 23.09.05-03.03.06; vital
42 kein Nonaplex und TPOX-vs, da SGM erfolgreich war H2O: 23.09.05-03.03.06; vital
36 8 *** *** 15 (?) 6/9 *** 31 16/18 14/15 XY H2O: 23.09.05-24.09.06; vital
37 9 *** *** *** 9(?) *** 29 14(?) 15/16 X H2O: 23.09.05-24.09.06
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 20(b): TPOX-vs und Nonaplex der in Wasser gelagerten Zähne
3.4 Der Sonnenstrahlung ausgesetzte Zähne
Proben Nr. 51 und 52 ergaben nach vier Wochen unter Sonneneinstrahlung bei dem
System TPOX-vs und bei dem Nonaplex-Multiplex eine eindeutige Typisierung. Die
DNA-Konzentration von 0,823 und 0,947 ng/μl war hierfür ausreichend.
Bereits nach einem Vierteljahr konnte bei den Proben 27 und 28 keine DNA mehr
quantifiziert werden. Ebenso erfolglos blieb die PCR mittels des STR-Systems SE33
und des SGM-Multiplex. Nur das System TPOX-vs konnte typisiert werden. Der
Nonaplex-Multiplex erbrachte bei Probe 27 drei typisierbare Loci (TH01, D3S1358
und AMEL) und bei Probe 28 lediglich eine typisierbaren Locus (TH01) hervor.
Nach einem halben Jahr zeigte die Probe des Zahns Nr. 29 mit keinem Kit eine
Typisierung. Auch die Quantifizierung konnte keine DNA nachweisen. Die Probe 30
war nur im System TPOX-vs typisierbar. Die zwei Loci im Nonaplex-Multiplex, welche
nur sehr schwache Peaks zeigten, können nicht zur eindeutigen Identifizierung
herangezogen werden.
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
51 0,823 kein SE33 und SGM, da TPOX-vs und Nonaplex gemacht wurde
52 0,947 kein SE33 und SGM, da TPOX-vs und Nonaplex gemacht wurde
27 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
28 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
29 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
30 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SE33 SGM
Tab. 21(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der Sonnenstrahlung ausgesetzten Zähne
Probennr.
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
51 8 14/19 20/24 17 6/9.3 12/13 28/31.2 16/17 17 X UV: 27.12.06-01.02.06
52 10/11 18/30.2 21/26 12 6/10 13 27/30 15/17 14 X UV: 27.12.06-01.02.06
27 9 *** *** *** 9.3 *** *** 17 *** XY UV: 04.08.-05.11.05; vital
28 8/9 *** *** *** 9.3 *** *** *** *** *** UV: 04.08.-05.11.05
29 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** UV: 04.08.05-03.03.06; vital
30 8/11 *** *** *** 6 *** *** *** *** X(?) UV: 04.08.05-03.03.06
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 21(b): TPOX-vs und Nonaplex der Sonnenstrahlung ausgesetzten Zähne
3.5 Zähne aus Sektionsgut
Bei Probe 33 (etwa 17 Tage Liegezeit) konnte 0,091 ng/μl DNA gewonnen werden.
Eine DNA-analytische Untersuchung mittels des Systems SE33 und des SGMMultiplex
war in allen Systemen möglich.
Probe 34 (etwa 14 Tage Liegezeit) lieferte keine quantifizierbare DNA mehr. Das
Untersuchungsergebnis mit dem STR-System SE33 war erfolgreich, mit dem SGMMultiplex
konnten drei Loci nicht (D18S51, TH01 und D2S1338) und fünf weitere nur
unsicher (FGA, D19S433, D21S11, vWA und D16S539) identifiziert werden.
Lediglich bei den Loci D8S1179, D3S1358 und AMEL konnten die Allele eindeutig
ermittelt werden.
SGM
FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
33 0,091 27,2/33,2 20/23 15,2 13/14 7/8 11/13 29/30 14 17 11/12 18/25 XY
34 < 5pg 18 21/22 (?) 16 (?) *** *** 11/14 28 (?) 17 19 (?) 12 (?) *** XY
Proben- SE33
nr
Menge in
ng/μl
Tab. 22(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der Zähne aus dem Sektionsgut
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
33 SE33 erfolgreich 27.2/26.2 20/23 13/14 7/8 11/13 29/30 14 17 XY verweste Leiche ~17d
34 SE33 erfolgreich *** *** *** 7/9 *** *** *** *** *** verweste Leiche ~14d
Proben- TPOX-vs Nonaplex Kommentar
nr
Tab. 22(b): TPOX-vs und Nonaplex der Zähne aus dem Sektionsgut
3.6 Starker Hitze ausgesetzte Zähne
Die DNA-Konzentration nahm bei zunehmender Hitzeexposition kontinuierlich ab.
Waren nach 30 min noch Konzentrationen von 0,154 ng/μl (Probe 11) und 1,79 ng/μl
(Probe 12) festzustellen, konnten nach 60 min nur noch Werte von <10 pg/μl (Probe
13) und 0,034 ng/μl (Probe 16) ermittelt werden. Alle Werte späterer Proben (Nr. 17 -
20) lagen unter der Nachweisgrenze.
Korrespondierend dazu verhält sich auch der Nachweis der verschiedenen Allele. Bei
den ersten Proben (Nr. 11 und 12) konnte das System SE33 verlässlich nachgewiesen
werden und auch beim SGM-Multiplex zeigten sich noch vier (Probe 11:
die Loci FGA, D19S433, D21S11 und AMEL) bzw. fünf (Probe 12: die Loci D19S433,
D8S1179, D21S11, vWA und AMEL) amplifizierbare Loci. Der Nonaplex-Multiplex
ergab nur bei Probe 11 im System D21S11 kein Ergebnis.
Proben 13 und 16, die nach 60 min entnommen wurden, brachten ebenfalls beim
STR-System SE33 ein Ergebnis. Mit dem SGM-Multiplex konnte jedoch nur noch bei
Probe 16 der Locus AMEL wiedergegeben werden, der allerdings nicht mit dem
Genus des Patienten übereinstimmte. Mit dem Nonaplex-Multiplex konnten zwar
mehr Loci typisiert werden (Probe 13: SE33, TH01, und AMEL; Probe 16: FGA,
TH01, D21S11, vWA und AMEL), dies reicht aber für eine zufriedenstellende
Identifizierung nicht aus.
90 min nach Versuchsbeginn wurden Proben Nr. 17 und 18 dem Wärmeschrank
entnommen. Probe 17 konnte noch beim System SE33 typisiert werden. Dies gelang
bei Probe 18 nicht mehr. Das SGM-Multiplex-Kit ermöglichte bei beiden Proben
keine Typisierung. Eine weitere Untersuchung der Probe 18 mit dem System
TPOX-vs konnte Allele darstellen. Die Untersuchung mit dem Nonaplex-Kit gestattete
bei beiden Proben eine Typisierung des AMEL-Locus und zusätzlich bei Probe 18
die Loci TH01 und D3S1358.
Die Zähne Nr. 19 und 20 wurden 120 min der Hitze ausgesetzt. Probe 19 konnte
beim System SE33 noch typisiert werden, Probe 20 ergab hierbei kein Ergebnis. Erst
unter Zuhilfenahme des Systems TPOX-vs gelang eine Typisierung. Der SGMMultiplex
konnte bei beiden keine Allele liefern. Der Nonaplex-Multiplex lieferte bei
beiden am Locus D21S11 verwertbare Allele, zusätzlich stellte sich am Locus TH01
bei Probe 20 ein Allel dar.
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
11 0,154 19/27,2 18,3 13/14 *** *** *** 32,2 *** *** *** *** Y
12 1,79 18/20 *** 14 *** *** 11/12 29/30 17/18 16/18 *** *** XY
13 < 10pg 18 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
16 0,034 27,2 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** X
17 < 5pg 32 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
18 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
19 < 5pg 20/28,2 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
20 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SE33 SGM
Tab. 23(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der starker Hitze ausgesetzten Zähne
Probennr.
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
11 SE33 erfolgreich 27.2/29.2 16/21 17 8/9.3 14 *** 14/17 16/17 XY Ofen: 30min/200°C; tief zerstört
12 SE33 erfolgreich 18/20 20/25 16 8/9.3 11/12 29/30 17/18 16/18 XY Ofen: 30min/200°C
13 SE33 erfolgreich 28.2 *** *** 6/8 *** *** *** *** XY Ofen: 60min/200°C
16 SE33 erfolgreich *** 18 *** 7 *** 27/36.2 *** 14 XY Ofen: 60min/200°C
17 SE33 erfolgreich *** *** *** *** *** *** *** *** XY(?) Ofen: 90min/200°C
18 8/11 *** *** *** 9 *** *** 17/18 *** XY Ofen: 90min/200°C
19 SE33 erfolgreich *** *** *** *** *** 34 *** *** *** Ofen: 120min/200°C
20 8/9 *** *** *** 6 *** 27/32.2 *** *** *** Ofen. 120min/200°C
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 23(b): TPOX-vs und Nonaplex der starker Hitze ausgesetzten Zähne
3.7 Vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne
Die Quantifizierung mit den Quantifiler Kit lieferte eine Menge von 4,25 bis 28,44
ng/μl. Eine Typisierung konnte in allen Systemen des SGM-Multiplex und im Einzel-
system SE33 erfolgen. Weitere Untersuchungen mit dem Nonaplex-Multiplex und
dem TPOX-vs brauchten daher nicht durchgeführt werden.
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
21 4,25 17/33,2 21/25 15/15,2 12 8 13/14 28/30 14/17 17 10/12 25/26 XY
22 27,98 16/28,2 18/21 15/16 14 7/9,2 12/14 30,2/31,2 15/16 16/19 11/13 16/17 XY
23 28,44 19 21/23 12/14 14/18 6/7 12/14 28/31 14/17 17 11/13 17/25 XY
SE33 SGM
Tab. 24: Quantifizierung, SE33 und SGM der vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierten Zähne
3.8 Zähne der Ausgrabung in Katzwang
Die gewonnenen Dentinspäne erbrachten keinen Nachweis von DNA mittels
Quantifizierung.
Keine der Proben konnte beim System SE33 oder dem SGM-Multiplex eine
Typisierung liefern. Bei Probe 38 konnte als einziges ein Allel beim System TPOX-vs
vermutet werden. Eine weitere Untersuchung mit dem Nonaplex-Multiplex ergab
ebenso keine Typisierung.
Proben- Menge in
nr. ng/μl FGA D19S433 D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA D16S539 D2S1338 AMEL
38 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
39 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
40 < 5pg *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SE33 SGM
Tab. 25(a): Quantifizierung, SE33 und SGM der Zähne der Ausgrabung in Katzwang
Probennr.
SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
38 9(?) *** *** *** *** *** *** *** *** *** Katzwang
39 *** kein Nonaplex, da bereits TPOX-vs nicht erfolgreich war Katzwang
40 *** kein Nonaplex, da bereits TPOX-vs nicht erfolgreich war Katzwang
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 25(b): TPOX-vs und Nonaplex der Zähne der Ausgrabung in Katzwang
3.9 Zähne aus der Dietersberghöhle
Das Quantifiler® Human DNA Quantification Kit ergab auch hierbei keinen DNANachweis.
Beim System TPOX-vs gelang bei Probe 48 als einzige eine Typisierung,
welche jedoch mit dem Nonaplex-Multiplex nicht weiter typisiert werden konnte.
Proben- Menge in
nr. ng/μl SE33 FGA D18S51 TH01 D8S1179 D21S11 D3S1358 vWA AMEL
48 < 5pg 10(?)/11 *** *** *** *** *** *** *** *** *** Dietersbergerhöhle
49 < 5pg *** kein Nonaplex, da TPOX-vs nicht erfolgreich war Dietersbergerhöhle
50 < 5pg *** kein Nonaplex, da TPOX-vs nicht erfolgreich war Dietersbergerhöhle
TPOX-vs Nonaplex Kommentar
Tab. 26: Quantifizierung, TPOX-vs und Nonaplex der Zähne aus der Dietersberghöhle


4 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich aus Zähnen genügend
brauchbare DNA zur Gewinnung eines „genetischen Fingerabdrucks“ gewinnen
lässt.
Die Analyse der in der Zahnpulpa gegen äußere Einflüsse gut geschützten DNA
nach unterschiedlich langen Liegezeiten, Hitzeeinwirkung, Sonnenbestrahlung mit
Einwirkung durch UV-Licht, Lagerung in Wasser oder Erde ließen unterschiedliche
Ergebnisse erwarten.
4.1 Methoden
4.1.1 Probenentnahme
Um eine Inhibition der PCR durch Hemmstoffe zu verhindern, müssen diese nach
Möglichkeit entfernt werden. Stoffe, die in diesem Fall in Erwägung gezogen werden
müssen, sind Huminsäure und Fulvinsäure, welche durch Abbauprozesse
organischen Materials entstehen. Der Einsatz moderner hoch entwickelter DNA-Kits,
wie das hier verwendete E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit, dienen der Abtrennung
dieser Stoffe (Burger et al. 1999).
Weiter ist darauf zu achten, dass an dem Zahn haftende Stoffe zu entfernen sind
bzw. mit NaOCl eventuell vorhandene DNA zerstört werden muss. Um auch an den
Gerätschaften befindliche DNA unbrauchbar zu machen, wurden sämtliche zur DNAExtraktion
verwendeten Geräte vor Gebrauch mit NaOCl abgewischt (Gilbert et al.
2005; Yang et al. 2003).
Auf eine Dekalzifizierung des Dentinpulvers wurde verzichtet, da sich im Dentin keine
Zellkerne befinden und somit keine DNA vorhanden ist. Studien bei der Aufarbeitung
von Kochenpulver belegen, dass dabei eine Dekalzifizierung nicht nötig ist, dass
sogar der Ertrag von DNA bei nicht dekalzifiziertem Knochenpulver doppelt so hoch
ist wie bei dekalzifiziertem Pulver, da jede zusätzliche Reinigung zu DNA-Verlust
führt. (Fisher et al. 1993).
Das Trepanieren von Zähnen nach entsprechender Reinigung und die Gewinnung
von Pulparesten mit einer feinen Pinzette oder mit Endonadeln war daher die
Methode mit den größten Erfolgsaussichten.
4.1.2 DNA-Extraktion
Das E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit basiert auf der Grundlage einer Silikamembran.
Das reversible Binden der DNA an Silikapartikel ist ein Standardverfahren, um die
DNA von nieder- und hochmolekularen Substanzen wie zellulärer Debris und
Proteinen zu trennen, welche die PCR inhibitieren können. Nach mehrmaligem
Waschen kann dann die DNA mittels Puffer wieder in Lösung überführt werden.
Allerdings sind die Silikapartikel selbst PCR-Inhibitoren, sodass diese vor der PCR
entfernt werden müssen (Höss et al. 1993; Günther et al. 1995). Durch Auftragen der
Silikapartikel auf eine Membran wie im E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit kann auf
diesen letzten Reinigungsschritt verzichtet werden.
Eine weitere Methode zur DNA-Gewinnung stellt das Phenol-Chloroform-Protokoll
dar. Dabei wird nach der Proteinase K-Verdauung eine Phenol-Chloroform-Fällung
durchgeführt. Der Nachteil dieser Methode ist, dass durch die Verwendung eines
organischen Lösungsmittels zwar störende Komponenten entfernt, aber bei alten und
bodengelagerten Proben auch Huminstoffe mit extrahiert werden. Diese Huminstoffe
können oftmals nicht komplett eliminiert werden, was bei der PCR zu Problemen
führen kann. Diese Methode ist sehr fehleranfällig und stellt eine hohe fachliche
Anforderung an den Labormitarbeiter da, wodurch es für den routinemäßigen
schnellen Einsatz ungeeignet ist. Daneben ist zu bemerken, dass ein Teil der DNA
bei der Fällung verloren geht (Baron et al. 1996). Durch diese Umstände ist dieses
Protokoll für diese Arbeit unzweckmäßig.
Andere DNA-Extraktionsprotokolle wie „Chelex“ oder „Boil“ scheiden ebenfalls für die
Verwendung in dieser Arbeit aus, da diesen ein stark denaturierendes Reagens fehlt,
welches Histone zerstören kann, die die DNA vor Verfall schützen (Hummel 2003,
S.61ff).
4.1.3 PCR
Das AmpFlSTR® SGM Plus Kit bietet die Möglichkeit zur Amplifizierung von zehn
tetranukleotiden STRs und Amlelogenin. Dabei sind die STRs so gewählt, dass sich
überlappende Systeme durch drei Farbmarkierungen unterscheiden lassen.
Neben den sieben europäischen Datenbanksystemen (European Standard Set =
ESS: TH01, vWA, D21S11, FGA, D3S1358, D8S1179 und D18S51) und vier weiteren
Systemen (D16S539, D2S1358, AMEL und D19S433) fehlt in diesem Set das in
der deutschen DAD (DNA-Analyse-Datei) vorhandene System SE33 (Patzelt et al.
2007, S. 513ff).
Dieses SE33 wurde als Einzelsystem ebenfalls in einer weiteren PCR eingesetzt. Da
bei einem Einzelsystem sowohl die Reagenzien, wie auch die Temperaturen
während der PCR besser an das System angepasst werden können, bietet dieses
eine sensiblere Typisierungsmöglichkeit als ein Multiplex-Ansatz.
Um zumindest einen Nachweis von vorhandener DNA zu erbringen, wurde versucht,
mit dem TPOX-vs eine Typisierung durchzuführen. Dieses verkürzte System (siehe
Kapitel 1.2.2.3, S. 4) gestattet auf DNA-Fragmente zurückzugreifen, die im Bereich
von 100 bp liegen. Hellmann et al. zeigten in ihrer Studie von 2001, bei der sie bei
telogenen Haaren eine Typisierung versuchten, wie viel sensibler die vs-STR-Systeme
im Gegensatz zu den konventionellen Systemen sind. Den Einsatz einer neuen
short pentaplex (ShoP) PCR bei der Analyse stark degradierter DNA bezeichneten
Meißner et al. 2007 als sehr wirkungsvoll. Die Anwendung solcher Multiplex-Kits
kann bei stark zerstörter DNA eine Typisierung ermöglichen.
Mit dem Mentype® NonaplexQS PCR Amplifikation Kit ist es möglich die acht für die
DAD geforderten STR-Systeme (ESS: TH01, vWA, D21S11, FGA, D3S1358,
D8S1179 und D18S51 + SE33) und Amelogenin zu amplifizieren. Dieses Kit bietet
höhere Sensibilität als das AmpFlSTR® SGM Plus Kit, da ähnlich wie bei den
vs-STRs die Primerbindungsstellen näher an die repetitive Sequenz gelegt werden
konnten und daher kürzere DNA-Fragmente zur Amplifizierung ausreichen. Des
Weiteren lassen sich laut Herstellerangaben Nullallele (siehe Kapitel 4.2.1, S. 50)
vermeiden, da bekannte Mutationen in der Primerbindungsstelle des SE33
kompensiert werden. Durch eine höhere Zyklenanzahl (35 Zyklen gegenüber 28
Zyklen beim SGM Multiplex) können auch noch schwache Allele erkennbar werden.
Wie beim AmpFlSTR® SGM Plus Kit werden auch hier Fluoreszenzfarbstoffe zur
Markierung sich überlappender Systeme verwendet.
Abb. 17 zeigt ein Beispiel, wie ein Elektropherogramm des Mentype® NonaplexQS mit
den vier Farbmarkierungen aussieht:
Abb. 17: Beispiel für ein Elektropherogramm des Mentype® NonaplexQS analysiert am ABI PRISM®
310 Analyser mit rot markiertem DNA-Längenstandard 550 (ROX) (Biotype AG, Produktinformation
Mentype® NonaplexQS)
Um das Optimum von 1,0-2,5 ng DNA im PCR-Ansatz zu erzielen, wurden je Probe
drei Ansätze mit unterschiedlicher Menge DNA angesetzt. Es wurde jeweils eine
Probe mit 1 μl, eine mit 5 μl und eine mit 10 μl DNA angesetzt. Bei zu geringer Menge
DNA kann eventuell keine Amplifikation stattfinden. Wenn zu viel DNA in den
PCR-Ansatz gegeben wird, kann es dazu kommen, dass die Reaktion aus Mangel an
Primern die exponentielle Phase der PCR nicht erreicht, in der die Zielfragmente
sehr effizient amplifiziert werden (Hummel 2003, S. 105f). Da viele DNAPolymerasen
beim abschließenden Extensionsschritt ein A-Nukleotid an das 3’-Ende
der Einzelstränge anfügen, wodurch –A zu +A Fragmenten werden, entstehen durch
einen Mangel an A-Nukleotiden zwei Peaks bei der Analyse mit der hochauflösenden
Kapillarelektrophorese. Daneben kann es bei der Analyse im GeneScan zu so
genannten „off-scale data“ führen (Wallin et al. 1998). Sutlovic et al. legten in einer
Studie 2005 dar, dass ab einer Menge von 100 ng Huminsäure pro 25 μl PCRAnsatz
die Polymerase komplett inhibiert wird, die PCR scheitert und zu falschnegativen
Ergebnissen führt Die in die PCR eingesetzte Menge DNA muss daher so
gering wie möglich gehalten werden, um auch die Menge an Huminsäure so gering
wie möglich zu halten. Humin- und Fulvinsäuren werden im Boden aus organischem
Material gebildet und bezeichnen hochmolekulare chemische Verbindungen (Yeates
et al. 1997). Um eine Kontamination durch anhaftende Erde und damit Humin- und
Fulvinsäure zu vermeiden, wurden vorsorglich alle äußeren Zahnoberflächen
gründlich gereinigt.
4.1.4 Real-Time-Quantitative-PCR (RTQ-PCR)
Die Real-Time-Quantitative-PCR (RTQ-PCR) mittels Quantifiler® Human DNA
Quantification Kit ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem
Prinzip der herkömmlichen PCR beruht und zusätzlich die Möglichkeit einer
Quantifizierung bietet. Dabei wird während der PCR-Zyklen die Zunahme der
Fluoreszenz und damit korrespondierend die Zunahme der DNA-Menge gemessen.
Eine Auftrennung mittels Gelelektrophorese ist dabei nicht nötig. Allerdings ist diese
Methode den gleichen Problemen wie die herkömmliche PCR unterworfen. PCRinhibierende
Stoffe können auch bei der RTQ-PCR zum Scheitern führen, weswegen
dem Kit BSA zugegeben ist. Des Weiteren ist eine gewisse Grundlänge der DNAFragmente
nötig, da eine 62 bp lange Struktur zu analysieren ist. Das Quantifiler®
Human DNA Quantification Kit gibt somit die Menge an amplifizierbarer DNA wieder.
Die Menge an stärker degradierter DNA ist damit nicht nachweisbar. Aus
stochastischen Gründen ist es dennoch möglich, dass vereinzelt STR-Systeme
typisiert werden können, wie beispielsweise die Proben 25 und 26 zeigen (Applied
Biosystems, QuantifilerTM Kits - User’s Manual).
4.2 Komplikationen und PCR-Artefakte
Die meisten Artefakte ergeben sich bei einer Erhöhung der Zyklenzahl bei der PCR.
Zwar steigt dadurch auch die Detektionswahrscheinlichkeit von sonst nicht erkannten
Allelen, aber auch die Anzahl von falsch-positiven Ergebnissen erhöht sich (Bower et
al. 2005). Das Hauptaugenmerk bei dieser Arbeit war nicht eine Erhöhung der
Zyklenzahl sondern eine Verminderung der Artefaktbildung.
Hierbei stellt wohl der „allelic dropout“ das größte Problem dar. Dass ein Geschlecht
falsch wiedergegeben wurde, konnte im Fall der Probe 31 belegt werden. Stotter-
banden konnten dank ihrer einfachen Identifizierung zwar beobachtet werden,
spielten aber bei der Analyse nur eine untergeordnete Rolle.
4.2.1 „allelic dropout“
Der Ausfall eines der beiden Allele eines heterozygoten Systems führt zur falschen
Annahme eines homozygoten Systems. Man spricht von einem „allelic dropout“. Dies
kann beispielsweise passieren, wenn sich durch Mutationen die Hybridisationssequenz
für die Primer so verändert hat, dass diese sich nicht mehr anlagern
können. Ein so verändertes Allel wird Nullallel genannt und wird in der PCR nicht
amplifiziert (Butler 2001).
Bei sehr wenig degradierter Ausgangs-DNA kann es ebenso durch Strangbrüche
zum Ausfall eines Allels kommen. Dabei ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass
zuerst Allele der großen Systeme wie D18S51, D2S1338, D16S539 oder FGA
ausfallen, bevor kleinere Systeme wie D19S433, AMEL, D3S1358 oder D8S1179
betroffen sind (Schmerer et al. 1999).
4.2.2 Falsche Geschlechtsangabe
Bei der Feststellung des Geschlechts einer Person, von der eine Probe stammt, kann
es passieren, dass eines der beiden Allele durch Degradation bereits zerstört worden
ist. Bei diesem „allelic dropout“ kann unter Umständen dennoch eine Genusbestimmung
möglich sein. Wenn das X-chromosomale Allel ausfällt und nur das Ychromosomale
Allel amplifiziert wird, ist die Probe korrekt als männlich zu
identifizieren (siehe Probe 11, Kapitel 3.6, S. 42). Fällt hingegen das Ychromosomale
Allel aus, wird die Probe als falsch-weiblich erkannt. Ein Indiz auf den
Ausfall des Y-chomosomalen Allels gibt bei Multiplexsystemen der Ausfall anderer
Systeme (Hummel 2003, S. 29f).
Da das Geschlecht der Personen, von denen die Proben stammten, bekannt war,
konnten durch einen Abgleich nur eine falsche Geschlechtszuordnung ermittelt
werden. Probe 31 brachte bei der Analyse ein falsch-weibliches Ergebnis.
4.2.3 Stotterbanden
Stotterbanden oder Schattenbanden entstehen durch das Verrutschen der
Polymerase („slippage“) um eine repetitive Einheit während der Neusynthetisierung.
Dabei kann das Verrutschen als „forward-slippage“ geschehen, wobei eine repetitive
Einheit übersprungen wird und der neue Strang kürzer wird, oder es kann als „backward-
slippage“ passieren, bei dem eine repetitive Einheit doppelt amplifiziert wird
und somit ein zu langer Strang entsteht. Je kleiner die repetitive Einheit ist, desto
ausgeprägter sind die Stotterbanden (siehe Abb. 18). Ebenso sind Systeme, bei
denen die repetitive Einheit die gleiche Kernsequenz vorweist, häufiger betroffen als
Systeme wie D21S11 oder FGA, die unterschiedliche Kernsequenzen enthalten. Die
Ausprägung der Stotterbanden ist bei größeren Allelen durch die höhere
Wahrscheinlichkeit von „slippages“ intensiver als bei kleinen Allelen (Walsh et al.
1996).
Durch den bei tetranukleotiden STR-Amplifikationsprodukten wesentlich geringer
ausgeprägten Peak vor bzw. nach einem Allel (siehe Abb. 18) sind die Stotterbanden
leicht identifizierbar. Regelmäßig konnten diese bei der Auswertung beobachtet und
berücksichtigt werden.
4.3 Ergebnisse
4.3.1 Frisch extrahierte Zähne
Die vor kurzer Zeit extrahierten Zähne dienten bei den ersten Untersuchungen dazu,
die Methode zu testen und zu überprüfen, ob sie für diese Zwecke geeignet ist. Bei
Abb. 18: Stotterbanden bei di- und tetranukleotiden STRAmplifikationsprodukten
(aus Hummel 2003, S. 36)
den Proben 1 bis 5 (alle Zähne waren vor der Zahnextraktion sensibel, was ein
Hinweis auf die Vitalität der Zähne ist; Weber 2003, S. 296) konnte eine DNAanalytische
Untersuchung mit dem System SE33 und dem SGM-Multiplex erfolgreich
verifiziert werden. Somit zeigte sich, dass die angewandten Kits, insbesondere das
E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit zur Isolierung der DNA, für diese Arbeit gut geeignet
waren.
Probe 6 stammte von einem asensiblen Zahn. Die Asensibilität von Zähnen kann
verschiedene Ursachen haben. Beispielsweise kann eine aggressive Karies bis zum
Pulpenkavum durchgebrochen sein und eine Pulpitis, also eine bakterielle
Entzündung des Zahnmarks, erzeugt haben, welche dabei das Gewebe irreversibel
degradiert. Weitere Ursachen für asensible Zähne können Traumata, Kronen oder
ein obliteriertes Pulpenkavum sein. Nach dem Ergebnis der Probe 6 hatte der Zahn
vermutlich eine irreversible Pulpitis, da eine tiefreichende kariöse Stelle vorhanden
war. Bei der Typisierung lieferte das System TPOX-vs ein eindeutiges Ergebnis, der
Nonaplex-Multiplex konnte nicht bei allen Loci ein vollständig detektierbares
Merkmalsmuster liefern. Dies lässt den Rückschluss zu, dass bereits degradierende
Vorgänge im Zahninneren eingesetzt hatten.
Das Ausgangsmaterial der Proben 7 bis 9 bestand aus drei tief zerstörten Zähnen.
Dennoch konnte noch keine direkte Verbindung zur Pulpa festgestellt werden, da der
Zahn bereits Tertiärdentin gebildet hatte. Da die dabei entstehende reversible
Pulpitis keine DNA-abbauenden Eigenschaften aufweist, konnten die Loci mittels
SGM-Multiplex eindeutig identifiziert werden.
Beim Probenzahn Nr. 14 konnte der Wurzelkanal kaum aufbereitet werden, weil das
Pulpenkavum nahezu vollständig obliteriert war. Obwohl die DNA-Konzentration
unter der Nachweisgrenze von 5 pg/μl lag, konnte hierbei noch das System TPOX-vs
und das kleine System TH01 des Nonaplex-Multiplex eine Typisierung liefern. Zur
Identifizierung sind diese beiden Systeme nicht mehr ausreichend, aber dennoch
belegt dies, dass sehr stark degradierte DNA noch vorhanden ist.
Beim Probenzahn Nr. 15 konnte trotz weit offener apikaler Foramina problemlos eine
DNA-Analyse mittels SGM-Multiplex und des Systems SE33 durchgeführt werden.
Bei der Aufbereitung konnte das eingetrocknete Nervengewebe im Ganzen
entnommen werden, was die hohe DNA-Ausbeute von 11,42 ng/μl erklärt. Dies lässt
den Schluss zu, dass weit offene Foramina bei frisch extrahierten Zähnen mit noch
nicht abgeschlossenem Wurzelwachstum die DNA-Typisierung nicht einschränken.
Die Zähne der Proben 24 und 25 waren mit Wurzelkanalfüllungen versorgt worden.
Dabei wurde entzündetes oder gangränöses Pulpengewebe herausgenommen und
der Wurzelkanal mit Endofeilen aufbereitet. Da es im Dentin kleine Ausbuchtungen
gibt und das apikale Delta nicht vollständig entfernt werden kann (siehe Kapitel 1.3,
S. 7), sind potentiell verwertbare, übrig gebliebene Zellen denkbar. Obwohl die DNAMenge
unter der Nachweisgrenze lag, konnte dennoch bei Probe 24, welche mit
einer ein Jahr alten Wurzelkanalfüllung versehen war, das System SE33 und die
meisten kleinen Systeme des Nonaplex-Multiplex erfolgreich typisiert werden.
Folglich war die gewonnene DNA zwar stark degradiert, aber dennoch nicht komplett
zerstört. Bei Probe 25, der Zahn hatte eine sechs Jahre alte Wurzelfüllung, war das
STR-System SE33 nicht erfolgreich. Allerdings zeigten das System TPOX-vs und
vereinzelte Loci der Multiplexe SGM und Nonaplex eine erfolgreiche Typisierung. Der
Locus D18S51 lieferte bei den beiden Kits SGM- und Nonaplex-Multiplex
unterschiedliche Allele, was den Schluss zulässt, dass entweder das Hintergrundrauschen
einen Peak vorgetäuscht hat oder bei den beiden Kits jeweils nur eines der
beiden Allele amplifiziert wurde. Die degradierenden Eigenschaften des oftmals bei
der Wurzelkanalaufbereitung eingesetzten NaOCl wirken nicht in voller Konzentration
in allen Seitenkanälen, sodass einige Systeme mit kurzen Amplifikationsprodukten
noch detektierbar bleiben. Eine Untersuchung von Zähnen mit Wurzelkanalbehandlung
bringt nicht immer gute Ergebnisse, kann aber auch Erfolge erzielen.
4.3.2 Im Erdboden vergrabene Zähne
Vergrabene Zähne wurden nach etwa vier Wochen (Zahn 10), vier Monaten (Zahn
26), einem halben Jahr (Zähne 31 und 32) und einem Jahr (Zähne 43, 44 und 45)
entnommen und analysiert.
Probe 10 konnte eine komplette Typisierung hervorbringen, kein Locus ist im SGMMultiplex
ausgefallen.
Nach drei Monaten (Probe 26) konnte schon eine leichte Degradation der DNA nachgewiesen
werden. Auch wenn das Einzelsystem SE33 noch typisiert werden konnte,
kann man sich bei fast allen Systemen des SGM-Multiplex nur auf Vermutungen über
die Allelzusammensetzung stützen. Das im SGM-Multiplex vermutete Allel des Locus
FGA wurde im Nonaplex-Multiplex um ein zweites Allel erweitert. Der Nonaplex
konnte komplett typisiert werden.
Ein halbes Jahr vergraben waren die Zähne der Proben 31 und 32. Bei beiden war
das System SE33 erfolgreich, jedoch sind beim SGM-Multiplex weitere Systeme
komplett ausgefallen und nur etwa die Hälfte der Loci wurde fraglich typisiert. Probe
31 ergab beim SGM-Multiplexlocus D21S11 ein Allelmuster von zwei Peaks, von
denen im Nonaplex nur eines typisiert werden konnte. Ebenso wurde bei Probe 31
mit dem SGM-Multiplex das Allel für „Y“ nicht amplifiziert. Der Nonaplex-Multiplex
brachte fast keinen Allelausfall.
Die Probenzähne 43, 44 und 45 wurden nach etwa einem Jahr aus dem Erdreich
entnommen. Bei diesen Proben konnten nur noch sehr vereinzelt Allele typisiert
werden. Der sehr kurze TPOX-vs und der Locus AMEL des Nonaplex konnten noch
bei allen drei Spuren erfolgreich amplifiziert werden.
Probe 26 und 31 zeigen, dass vermutete Allele des SGM-Multiplex nicht unbedingt
dem tatsächlichen Allelbestand entsprechen müssen, sondern nur Hinweise auf
mögliche Allele geben. Die meisten der im SGM-Multiplex vermuteten Allele konnten
allerdings mit Hilfe des Nonaplex-Multiplex verifiziert werden.
In den ersten vier Wochen war die gewonnene DNA soweit intakt, dass eine
Typisierung erfolgreich verlief. Erste Degradationserscheinungen lassen sich nach
vier Monaten feststellen und nehmen kontinuierlich zu, bis nach einem Jahr fast keine
verwertbare DNA mehr vorhanden ist.
In der Studie von Pfeiffer et al. aus dem Jahr 1999 konnte gezeigt werden, dass bei
bodengelagerten Zähnen bereits nach sechs Wochen Systeme, die Fragmente
länger als 500 bp benötigen (in diesem Fall das System D1S80), nicht mehr erfolgreich
amplifizierbar waren. Selbst nach 18 Wochen konnte das System vWA in nur
vier von zwölf Fällen und das System TH01 in lediglich zwei von zwölf Fällen
detektiert werden. Auch ein rapider Abfall der DNA-Konzentration konnte zwischen
der 6. und 18. Woche beobachtet werden.
Murakami et al. konnten im Jahr 2000 bei ihren Untersuchungen zur Geschlechtsbestimmung
von Zahnproben mittels PCR zeigen, dass diese bei bis zu acht Wochen
im Erdreich gelagerten Zähnen kein Problem darstellte.
Die Ergebnisse der aufgeführten Studien werden durch diese Arbeit bestätigt.
4.3.3 In Wasser gelagerte Zähne
Nach etwa drei Monaten (Zahn 35), sechs Monaten (Zähne 41 und 42) und zwölf
Monaten (Zähne 36 und 37) wurden die in Wasser gelagerten Zähne entnommen
und bis zur Verarbeitung eingefroren.
Bei Probe 35 gelang bei dem Systems SE33 und dem Nonaplex-Multiplex in allen
Systemen eine Typisierung, allerdings konnte der SGM-Multiplex nicht an allen Loci
eindeutig bestimmt werden. Drei Systeme dieses Multiplex fielen aus. Die vermutlich
typisierten Systeme des SGM-Multiplex stimmten mit denen des Nonaplex-Multiplex
überein.
Die ein halbes Jahr in Wasser gelegenen Proben 42 und 43 konnten bei dem System
SE33 und dem SGM-Multiplex typisiert werden, sodass weder der TPOX-vs, noch
der Nonaplex herangezogen werden musste.
Nach einem Jahr konnte mit dem Quantifizierungskit keine DNA mehr nachgewiesen
werden. Die Systeme SE33 und TPOX-vs waren bei Probe 36 erfolgreich, aber
sowohl beim SGM-Multiplex, als auch beim Nonaplex-Multiplex konnte nur etwa die
Hälfte der Loci amplifiziert werden. Bei Probe 37 konnte weder mit dem System
SE33 noch mit dem SGM-Multiplex eine Typisierung erbracht werden. Das System
TPOX-vs konnte ein erfolgreich typisiertes Ergebnis liefern und auch der Nonaplex-
Multiplex konnte in der Hälfte der Systeme typisiert werden.
Degradationserscheinungen traten bei den in Wasser gelagerten Zähnen erst
zwischen einem halben bis einem Jahr in Erscheinung. Diese späte Degradation
lässt sich besonders auf das Fehlen von UV-Strahlung und die moderate Temperatur
im Heizungskeller (~20 °C) zurückführen.
Dass bei Probe 35 bereits nach wenigen Monaten der SGM-Multiplex erfolglos blieb,
könnte daran liegen, dass bereits DNA-degradierende Vorgänge zum Zeitpunkt der
Zahnextraktion vorhanden waren, wie sie auch bei äußerlich unversehrten Zähnen
durch eine Paro-Endo-Läsion (siehe Kapitel 1.3, S. 8) vorkommen können. Nicht nur
die DNA-Qualität, sondern auch deren Quantität könnte in diesem Fall eine
erfolgreiche DNA-Analyse mittels SGM verhindert haben.
Alvarez Garcia et al. konnten in ihrer Studie 1996 nach drei Monaten das System
TH01 bei vier von sechs Proben und nach sechs Monaten bei zwei von sechs
Proben typisieren. Das Amelogeninsystem konnte nach beiden Zeitspannen bei allen
Proben typisiert werden. In diesem Bereich decken sich die Ergebnisse von Alvarez
Garcia et al. größtenteils mit dieser Arbeit.
4.3.4 Der Sonnenstrahlung ausgesetzte Zähne
Nach etwa einmonatigem (Zähne 51 und 52), dreimonatigem (Zähne 27 und 28) und
sechsmonatigem (Zähne 29 und 30) Aussetzen der Sonnenstrahlung wurden diese
Zähne der Analyse zugeführt.
Vier Wochen unter Sonneneinstrahlung ergab bei den Proben Nr. 51 und 52 im
System TPOX-vs und im Nonaplex-Multiplex bei einer DNA-Konzentration von 0,823
und 0,947 ng/μl eine eindeutige Typisierung.
Nach einem Vierteljahr konnte bei den Proben 27 und 28 keine DNA mehr
quantifiziert werden. Ebenso erfolglos blieb die PCR mit dem Einzelsystem SE33 und
dem SGM-Multiplex. Das System TPOX-vs konnte typisiert werden. Mittels
Nonaplex-Multiplex konnten Systeme mit sehr kurzen Amplifikationsprodukten
vereinzelt dargestellt werden.
Die Probe des Zahns Nr. 29 zeigte nach einem halben Jahr mit keinem Kit eine
Typisierung. Auch die Quantifizierung konnte keine DNA nachweisen. Die Probe 30
lieferte nur im System TPOX-vs eine Typisierung. Die zwei Loci im Nonaplex-
Multiplex, welche man vermuten kann, können nicht zu einer eindeutigen
Identifizierung heran gezogen werden.
Schon seit langem werden UV-Strahlen zur Sterilisation von Luft, Wasser und
Oberflächen eingesetzt. Speziell die Lichtwellenlänge der UV-C-Strahlung von 200
bis 300 nm wird von der DNA absorbiert und zerstört somit deren Struktur. Daher ist
es nicht verwunderlich, dass ein Zahn, der in gewissem Maße transluzent ist, das
Pulpengewebe im Inneren nur eingeschränkt vor der Strahlung schützen kann und
es nach wenigen Monaten zu Degradationerscheinungen der DNA kommen konnte.
Weitere Umweltfaktoren wie Hitze und Feuchtigkeit, denen die Zähne im Versuchszeitraum
ausgesetzt waren, haben ebenfalls zum weiteren Zerfall der DNA
beigetragen.
Bei den erfolgreich typisierten Proben 51 und 52 muss darauf hingewiesen werden,
dass diese zu einer kühleren Jahreszeit der Sonnenstrahlung ausgesetzt waren.
Sowohl der flachere Einfallswinkel der Sonnenstrahlung, als auch die winterlichen
Temperaturen müssen bei der Betrachtung berücksichtigt werden.
4.3.5 Zähne aus Sektionsgut
Die zwei Zähne aus der alltäglichen Sektionsarbeit (Zähne Nr. 33 und 34) ergaben
zwei sehr unterschiedliche Ergebnisse. Während bei Probe 33 (etwa 14 Tage Liegezeit
bis zum Auffinden) mit 0,091 ng/μl zwar relativ wenig DNA gewonnen werden
konnte, aber dennoch eine Analyse mittels SE33 und SGM möglich war, war bei
Probe 34 (etwa 17 Tage Liegezeit bis zum Auffinden) keine DNA mehr
quantifizierbar. Das Einzelsystem SE33 war erfolgreich. Mit dem SGM-Multiplex
konnten drei Systeme nicht und fünf nur vermutlich detektiert werden. Lediglich bei
den drei kleinsten Systemen waren die Allele eindeutig ermittelbar.
Probe 34 war die einzige Probe, bei der im Nonaplex-Multiplex weniger Loci erkannt
wurden als im SGM-Multiplex.
Vielfältige Gründe können hierzu beigetragen haben. Dazu tragen unter anderem
Mikroorganismen bei, die für die Verwesung gestorbener Lebewesen verantwortlich
sind. DNA-Untersuchungen an Zähnen aus Massengräbern in Kroatien, Bosnien und
Herzegowina von Alonso et al. aus dem Jahre 2001 haben hierbei 32 Bakterienarten
identifizieren können, die teilweise auch Bestandteil der physiologischen Keimflora
der Mundhöhle sind. Beispiele hierfür sind verschiedene Arten von Laktobazillen,
Pseudomonas, Staphylokokken und Streptokokken.
4.3.6 Starker Hitze ausgesetzte Zähne
Vier Mal wurden je zwei Zähne aus dem auf 200 °C vorgeheizten Wärmeschrank
entnommen, nach 30 min (Zähne Nr. 11 und 12), nach 60 min (Zähne Nr. 13 und
16), nach 90 min (Zähne Nr. 17 und 18) und nach 120 min (Zähne Nr. 19 und 20).
Die DNA-Konzentration nahm dabei kontinuierlich ab. Nach 90 min lagen alle Werte
unter der Nachweisgrenze.
Korrespondierend dazu verhält sich auch der Nachweis der verschiedenen Allele. Bei
den ersten Proben (Nr. 11 und 12) konnte das System SE33 verlässlich nach-
gewiesen werden und auch beim SGM-Multiplex zeigten sich noch vier (Probe Nr.
11) bzw. fünf (Probe Nr. 12) amplifizierbare Systeme. Der Nonaplex-Multiplex lieferte
bei beiden Proben eine eindeutige Identifizierung.
Proben 13 und 16, die nach 60 min entnommen wurden, ergaben ebenfalls beim
Einzelsystem SE33 eine Typisierung. Mit dem SGM-Multiplex konnte jedoch nur
noch bei Probe 16 der Locus AMEL wiedergegeben werden, der allerdings nicht mit
dem Genus des Patienten übereinstimmte. Mit dem Nonaplex-Multiplex konnten
zwar bei beiden Proben mehr Loci typisiert werden, dies reicht aber für eine
vollständige Identifizierung nicht aus.
90 min nach Versuchsbeginn wurden Proben Nr. 17 und 18 dem Wärmeschrank
entnommen. Probe 17 konnte noch beim System SE33 typisiert werden. Dies gelang
bei Probe 18 nicht mehr. Der SGM-Multiplex lieferte bei beiden Proben keine
Typisierung mehr. Eine weitere Untersuchung der Probe 18 mit dem System TPOXvs
konnte Allele darstellen. Die Untersuchung mit dem Nonaplex-Multiplex ergab bei
beiden Proben eine Typisierung des AMEL-Locus und zusätzlich bei Probe 18 die
Loci TH01 und D3S1358.
Die Zähne Nr. 19 und 20 wurden 120 min der Hitze ausgesetzt. Probe 19 konnte
beim STR-System SE33 noch typisiert werden, Probe 20 brachte hierbei kein Ergebnis.
Erst unter Zuhilfenahme des Systems TPOX-vs gelang eine Typisierung. Der
SGM-Multiplex konnte bei beiden keine Allele hervorbringen. Der Nonaplex-Multiplex
lieferte bei beiden am Locus D21S11 verwertbare Allele, zusätzlich zeigte sich bei
Probe 20 am Locus TH01 ein Allel.
Bei einigen Studien wurden Zähne zwei Minuten bei verschiedenen Temperaturen
gelagert und anschließend versucht, eine Geschlechtsbestimmung durchzuführen.
Dies stellte bis 200 °C kein Problem dar. Erst bei 250 °C gelang es vereinzelt nicht
mehr und bei 300 °C war dies nur noch in wenigen Fällen möglich (Tsuchimochi et
al. 2002; Murakami et al. 2000).
Williams et al. verlängerten bei ihrer Studie die Zeit auf 15 min und untersuchten die
Lagerung der Zähne zwischen 100 bis 500 °C mit anschließender Amplifizierung des
Amelogeninsystems. Als Ergebnis stellen sie ebenfalls fest, dass bis 200 °C eine
Typisierung des Geschlechts möglich ist. Darüber hinaus konnten auch sie bis
höchstens 400 °C vereinzelte Erfolge darlegen (Williams et al. 2004).
Bei Hitzeeinwirkung ergaben sich auch dieser Arbeit je nach Temperatur und
Einwirkzeit nicht immer brauchbare Ergebnisse. Eine Auswertung sollte trotzdem
regelmäßig versucht werden.
4.3.7 Vor 28 bzw. 29 Jahren extrahierte Zähne
Die Typisierung der Proben 21, 22 und 23 konnte in allen Systemen des SGMMultiplex,
wie auch im STR-System SE33 erfolgreich durchgeführt werden.
Da bei trockenen Bedingungen hydrolytische und oxidative Beschädigungen der
DNA vermindert werden, wurden diese trocken aufbewahrten Zähne erfolgreich
typisiert. Die Aufbewahrung in einem Schrank hat die Zähne vor der Einwirkung von
UV-Strahlen geschützt, sodass die DNA in keinem nennenswerten Maße zerstört
wurde.
Eine Studie von Alvarez Garcia et al. aus dem Jahre 1996 zeigte ebenfalls, dass bei
DNA-Material von 10 bis 30 Jahre alten Zähnen die Typisierung des Systems
Amelogenin problemlos möglich war.
4.3.8 Zähne der Ausgrabung in Katzwang
Bei allen drei Zähnen aus Katzwang (Nr. 38, 39 und 40), die archäologisch auf ein
Alter von 380 – 550 Jahre datiert worden waren, konnte mit keinem Kit ein Ergebnis
amplifiziert werden. Der TPOX-vs der Probe 38 ergab einen sehr schwachen Peak
im GeneScan, der sich kaum vom Hintergrundrauschen abhob und deshalb nicht als
Typisierung in Erwägung gezogen werden kann.
Der genaue Grund für den Ausfall lässt sich schwer nachvollziehen. Vermutlich
haben Mikroorganismen in der Zeit vor der Ausgrabung bereits zu massiver
Degradation der DNA beigetragen. Die genauen geologischen Verhältnisse am
Fundort in 70 cm Tiefe sind nicht bekannt. Die zweijährige Lagerung im Keller der
NHG fand unter trockenen und kühlen Bedingungen statt, sodass diese Zeitspanne
keinen großen Einfluss mehr ausgeübt haben dürfte.
4.3.9 Zähne aus der Dietersberghöhle
Die Proben 48, 49 und 50 (drei Zähne aus der Dietersberghöhle) wurden
ausschließlich dem TPOX-vs unterzogen, da es hier auf Grund der langen Liegedauer
von etwa 2300-2800 Jahren in erster Linie darum ging, überhaupt DNA
nachzuweisen. So war es auch nicht verwunderlich, dass die Quantifizierung keinen
DNA-Nachweis ergab. Umso erstaunlicher ist, dass bei der Probe 48 beim System
TPOX-vs Allele vermutet werden konnten. Der anschließend durchgeführte Nonaplex
blieb jedoch erfolglos.
Wie bereits bei den von der Ausgrabung in Katzwang stammenden Zähnen (Kapitel
4.3.8, S. 59) ist die lange Lagerung in der Erde sicherlich ein Teilaspekt für die
schlecht ausgefallene Typisierung. Ebenso sind die wechselnden Lagerbedingungen
in der NHG für die DNA-Konservierung nicht günstig gewesen. Dabei fallen die sechs
Jahre Lagerung im relativ konstant kühlen und trockenen Keller der NHG (2000 bis
2006) gegenüber den 72 Jahren (1928 bis 2000), in denen die Zähne am Dachboden
ständigen Temperaturschwankungen ausgesetzt waren und in denen kriegsbedingt
verschiedene Umzüge stattgefunden haben, nicht sehr ins Gewicht. Burger et al.
legten in ihrer Studie von 1999 bereits dar, dass eine lange Lagerung außerhalb
eines Gefrierschrankes die DNA-Ausbeute erheblich mindert.
4.4 DNA-Analyse bei archäologischen Skelettfunden
Es gelang Wissenschaftlern, erfolgreiche DNA-Extraktionen bei einem 2.000 Jahre
alten, mumifizierten Leichnam aus China durchzuführen (Hummel 2003, S. 2).
2008 haben Forscher aus einer Darmprobe die mt-DNA der etwa 5.300 Jahre alten
Gletschermumie „Ötzi“ erstmals komplett entziffert (Madersbacher 2008).
Bei noch vorhandenen Weichgewebe, zum Beispiel Mumien mit eingetrocknetem
Gewebe und dem seltenen Fall einer Gletscherleiche, kann wegen der im Vergleich
zum Hartgewebe schnelleren und einfacheren Extraktion im Regelfall dies zunächst
zur Untersuchung herangezogen werden.
Bei älteren Skelettfunden ohne mumifizierte Weichgewebsreste sind mit Knochenpulver
bessere Ergebnisse zu erwarten als aus Zähnen, da Zellen mit Zellkernen im
Knochen eingeschlossen sind.
DNA lässt sich auch aus prähistorischem Knochenmaterial extrahieren (Patzelt et al.
2003, S. 1045).
Wegen seiner physikalischen Härte und der engen Verflechtung organischer und
anorganischer Bestandteile resultiert eine gute Konservierung der DNA in der dichten
äußeren Knochenschicht (Substantia compacta). Die im Zellkern der Osteoblasten
befindliche DNA ist dort gut vor postmortalem enzymatischem Abbau geschützt
(Goehtz 2006).
Höss und Pääbo konnten 1993 noch DNA-Sequenzen aus Skelettfunden einer vor
25.000 Jahren ausgestorbenen Wildpferdart amplifizieren.
Zur Untersuchung von DNA aus Zähnen eignen sich besonders frische oder bis zu
wenigen Jahrzehnten alte Zähne. In dieser Arbeit war bei trocken gelagerten 28 Jahre
alten Zähnen DNA noch gut typisierbar.
Besonders der Einwirkung konzentrierter mineralischer Säuren widerstehen Zähne
für längere Zeit und diese können noch untersucht werden, wenn die Knochensubstanz
bereits zerstört ist (Rötzscher 2003, S. 1650).
Bei Großkatastrophen oder in unzugänglichen Gebieten erhält man nach Entfernung
eines Zahnes ein leicht zu handhabendes Körperteil mit geschützter und für eine
Analyse gut brauchbarer DNA.


5 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde überprüft, inwieweit sich verschiedene Lagerungsbedingungen
von Zähnen auf die Verwertbarkeit von DNA im Zahninneren zur Gewinnung eines
genetischen Fingerabdrucks auswirken.
Die Untersuchungen an frisch extrahierten Zähnen ließen erkennen, dass die in
dieser Arbeit verwendeten Methoden und DNA-Kits für die weitere Analyse der den
unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzten Zähne geeignet sind.
Asensible Zähne weisen bereits bei der Zahnextraktion Zeichen von Degradation auf.
Dagegen ist der kariöse Zerstörungsgrad an sich noch kein Ausschlusskriterium.
Bei wurzelkanalbehandelten Zähnen konnten nur Systeme mit sehr kurzen
Amplifikationsprodukten typisiert werden. Sie waren für eine genetische
Identifizierung kaum geeignet.
Bei der Analyse im Erdreich vergrabener Zähne nahm die Anzahl der typisierbaren
Systeme nach einem Vierteljahr Liegezeit kontinuierlich ab, bis schließlich nach
einem Jahr nur noch vereinzelt kleine Systeme detektiert werden konnten.
Ein anderes Bild zeigte sich bei den in Wasser gelagerten Zähnen. Bis zu einem
halben Jahr nach Versuchsbeginn konnte eine Typisierung aller Systeme durchgeführt
werden. Erst nach einem Jahr war die Degradation so weit vorangeschritten,
dass große Systeme keine Typisierung mehr erlaubten.
Bei Zähnen, die der Sonnenstrahlung einen Monat ausgesetzt waren, war es
dagegen problemlos möglich, einen vollständigen genetischen Fingerabdruck zu
erfassen. Nach drei Monaten konnten allerdings nur noch vereinzelt sehr kleine
Systeme gewonnen werden. Nach einem halben Jahr ergab lediglich der TPOX-vs
eine erfolgreiche Typisierung. UV-Strahlung kann Zahnschmelz und –dentin
durchdringen und DNA in recht kurzer Zeit degradieren.
Die Zähne aus dem Sektionsgut des Instituts für Rechtsmedizin Würzburg lieferten
unterschiedliche Ergebnisse, sodass hierzu keine generelle Aussage gemacht
werden kann.
Bei der Behandlung der Zähne mit Hitze von 200 °C konnte die DNA nur begrenzte
Zeit vor Degradation geschützt werden. Bereits nach einer halben Stunde waren
große Teile der Multiplex-Kits nicht mehr für eine Typisierung verwertbar. Das STRSystem
SE33 konnte allerdings noch ermittelt werden. Die Entnahmen zu späteren
Zeitpunkten (60 min, 90 min und 120 min) lieferten fast nur noch einzelne STRSysteme.
Eine knapp 30-jährige trockene Lagerung von Zähnen in einem Schrank mit Schutz
vor Sonneneinstrahlung schadete der DNA-Analysierbarkeit kaum.
Ein vollständiger Ausfall aller Systeme musste bei den Zahnproben von der
Ausgrabung in Katzwang verzeichnet werden. Die Zähne dieser 380 bis 550 Jahre
alten Schädel lieferten kein auswertbares DNA-Material mehr.
Ebenso konnte mit diesen Untersuchungsmethoden aus den 2300 bis 2800 Jahre
alten Zähnen aus der Dietersberghöhle kein analysierbares DNA-Material gewonnen
werden.
Es zeigte sich, dass Lagerbedingungen einen entscheidenden Einfluss auf die DNAQualität
ausüben. Als DNA-schädigende Einflüsse können neben Mikroorganismen
und Feuchtigkeit insbesondere UV-Strahlung und Hitze gelten. Der Faktor Zeit spielt
bei günstigen Lagerbedingungen eine untergeordnete Rolle.
Weitere Untersuchungen könnten noch versuchen, mitochondriale DNA zu
amplifizieren, da von dieser 100-1000 Kopien pro Zelle vorliegen. So gelang es
beispielsweise Pääbo et al. aus 7.000 Jahren alter mtDNA das Gen cyt b2 zu
vervielfältigen. Lawlor et al. gelang dies bei einem Segment des HLA-Gens aus
7.500 Jahren alter mtDNA (Newton et al. 1994, S. 113).


6 Literaturverzeichnis
Allen RC, Graves C, Budowle B (1989) Polymerase chain reaction amplification
products separated on rehydratable polyacrylamide gels and stained with silver.
Biotechniques 7(7): 736-744.
Alonso A, Andelinovic S, Martin P, Sutlovic D, Erceg I, Huffine E, Fernandez de
Simon L, Albarran C, Definis-Gojanovic M, Fernandez-Rodrigues A, Garcia P, Drmic
I, Rezic B, Kuret S, Sancho M, Primorac D (2001) DNA typing from skeletal remains:
Evaluation of multiplex and megaplex STR systems on DNA isolated from bone and
teeth samples. Croat. Med. J. 42(3): 260-266.
Alvarez Garcia A, Munoz I, Pestoni C, Lareu MV, Rodriguez-Calvo MS, Carracedo A
(1996) Effect of environmental factors on PCR-DNA analysis from dental pulp. Int. J.
Legal Med. 109(3): 125-129.
Applied Biosystems (2006) AmpFlSTR® SGM Plus® PCR Amplification Kit – User’s
Manual, Weiterstadt.
Applied Biosystems (2006) QuantifilerTM Kits – QuantifilerTM Human DNA
Quantification Kit and QuantifilerTM Y Human Male DNA Quantification Kit – User’s
Manual, Weiterstadt.
Bär W, Brinkmann B, Budowle W, Carracedo A, Gill P, Holland M, Lincoln PJ, Mayr
W, Morling N, Olaisen B, Schneider PM, Tully G, Willson M (2000) DNA commission
of the international society for forensic genetics: guidelines for mitochondrial DNA
typing. Int. J. Legal Med. 113: 193-196.
Bang G, Ramm E (1970) Determination of age in humans from root dentin
transparency. Acta Odontol. Scand. 28: 3–35.
Baron H, Hummel S, Herrmann B (1996) Mycobacterium tuberculosis complex DNA
in ancient human bones. J. Archaeol. Sci. 23: 667-671.
Baum N (1999) Die Dietersberghöhle bei Egloffstein, Kr. Forchheim - von der
Opferhöhle zum Bestattungsplatz. Prähistorische Zeitschrift 74(1): 79-121.
Bower MA, Spencer M, Matsumura S, Nisbet RER, Howe CJ (2005) How many
clones need to be sequenced from a single forensic or ancient DNA sample in order
to determine a reliable consensus sequence? Nucleic Acids Res. 33(8): 2549-2556.
Burger J, Hummel S, Herrmann B, Henke W (1999) DNA preservation: A
microsatellite-DNA study on ancient remains. Electrophoresis 20(8): 1722-1728.
Biotype AG (2006) Mentype® NonaplexQS PCR Amplification Kit –
Gebrauchsanleitung, Dresden.
Biotype AG: en.biotype.de/index.php;
Itemid=23#download (aufgerufen am 03.04.07).
Biotype AG, Produktinformation Mentype® NonaplexQS: www.biotype.de/files/
downloads/produkte/mentype/Produktinformation_Mentype_NonaplexQS.pdf (aufgerufen
am 08.04.07).
Butler JM (2001) Forensic DNA typing - Biology and technology behind STR
markers. Academic Press, San Diego.
Clement JG, Winship V, Ceddia J, Al-Amad S, Morales A, Hill AJ (2006) New software
for computer-assisted dental-data matching in Disaster Victim Identification and
long-term missing persons investigations: "DAVID Web". Forensic Sci. Int. 159(1):
24-29.
Comey CT, Koons BW, Presley KW, Smerick JB, Sobieralski CA, Stanley DM,
Baechtel FS (1994) DNA extraction strategies for amplified fragment length
polymorphism analysis. J. Forensic Sci. 39(5): 1254-1269.
Erl JR (1953) Abhandlungen der Naturhistorischen Gesellschaft zu Nürnberg XXXVI.
Band, Heft 5 – Die Dietersberghöhle bei Egloffstein. Naturhistorische Gesellschaft
Nürnberg, Nürnberg.
Fischer H (1935) Handbuch für Dentisten, Band II. Apollonia-Verlag Klaus Fürst,
München.
Fisher DL, Holland MM, Mitchell L, Sledzik PS, Webb Wilcox A, Wadhams M, Weedn
VW (1993) Extraction, evaluation and amplification of DNA from decalcified and
undecalcified United States Civil War bone. J. Forensic Sci. 38(1): 60-68.
Geserick G, Roewer L (1998) Beiträge der modernen Hämogenetik zur Identifikation.
In: Leopold D. (Hrsg.) Identifikation unbekannter Toter: interdisziplinäre Methodik,
forensische Osteologie. Schmidt-Römhild, Lübek, 327-355.
Gilbert MTP, Rudbeck L, Willerslev E, Hansen AJ, Smith C, Penkman KEH,
Prangenberg K, Nielsen-Marsh CM, Jans ME, Arthur P, Lynnerup N, Turner-Walker
G, Bibble M, Kiolbye-Biddle B, Collins MJ (2005) Biochemical and physical correlates
of DNA contaminatin in archaeological human bones and teeth excavated at Matera,
Italy. J. Archaeol. Sci. 32: 785-793.
Glass RT (2005) Forensic dentistry in a terrorist world. N. Y. State Dent. J. 71(3): 21-
25.
Goehtz F (2006) DNA-analytische Identifizierung unter Verwendung von frischem
und gelagertem Skelettmaterial. Inaugural – Disseratation zur Erlangung der
Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität
Würzburg.
Günther S, Herold J, Patzelt D (1995) Extracting of high quality DNA from bloodstains
using diatoms. Int. J. Legal Med. 108(3): 154-156.
Hammond HA, Jin L, Zhong Y, Caskey CT, Chakraborty R (1994) Evaluation of 13
short tandem repeats loci for use in personal identification applications. Am. J. Hum.
Genet. 55: 175-189.
Hellmann A, Rohleder U, Schmitter H, Wittig M (2001) STR typing of human telogen
hairs - a new approach. Int. J. Legal Med. 114(4-5): 269-273.
Hellwig E, Klimek J, Attin Th (2003) Einführung in die Zahnerhaltung. Urban &
Fischer, München.
Höss M, Pääbo S (1993) DNA extraction from Pleistocene bonesby a silica-based
purification method. Nucleic Acids Res. 21(16): 3913-3914.
Horn GT, Richards B, Klinger KW (1989) Amplification of a highly polymorphic VNTR
segment by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17: 2140.
Hühne J, Pfeiffer H, Brinkmann B (1999) Heteroplasmic substitution in the
mitochondrial DNA control region in mother and child samples. Int. J. Legal Med.
112: 27-30.
Hummel S (2003) Ancient DNA typing: methods, strategies and applications.
Springer, Berlin.
Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL (1985) Individual-specific ‘fingerprints’ of human
DNA. Nature 316: 76-79.
Kimpton CP, Gill P, Walten A, Urquhart A, Millican ES, Adams M (1993) Automated
DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR
Methods Appl. 3: 13-22.
Kreutzig Th (2002) Kurzlehrbuch Biochemie. Urban & Fischer, München.
Lehmann KM, Hellwig E (2002) Zahnärztliche Propädeutik. Urban & Fischer,
München.
Lippert H (2003) Lehrbuch Anatomie. Urban & Fischer, München.
Madersbacher F (2008) Ötzi. Curr. Biol. 18(21): R990-R991.
Mannucci A, Sullvan KM, Ivanov PL, Gill P (1994) Forensic application of a rapid
quantitative DNA sex test by amplification of the X-Y homologous gene amelogenin.
Int. J. Legal Med. 106(4): 190-193.
Meißner C, Bruse P, Müller E, Öhmichen M (2007) A new sensitive short pentaplex
(ShoP) PCR for typing of degraded DNA. Forensic Sci. Int. 166(2-3): 121-127.
Möller A, Brinkmann B (1994) Locus ACTBP2 (SE33) – Sequencing data reveal
considerable polymorphism. Int. J. Legal Med. 106(5): 262-267.
Mühldorfer, B (persönliche Mitteilung).
Murakami H, Yamamoto Y, Yoshitome K, Ono T, Okamoto O, Shigeta Y, Doi Y,
Miyaishi S, Ishizu H (2000) Forensic study of sex determination using PCR on teeth
samples. Acta Med. Okayama 54(1): 21-32.
Newton CR, Graham A (1994) PCR. Spektrum, Berlin.
Patzelt D, Baur MP, Bertrams J (2003) Forensische Serologie/Hämogenetik. In:
Madea B, Brinkmann B (Hrsg.) Handbuch gerichtliche Medizin 2. Springer-Verlag,
Berlin, S. 991-1115.
Patzelt D, Schneider PM (2007) Forensische Serologie/Molekulare Genetik. In:
Madea B (Hrsg.) Praxis Rechtsmedizin – Befunderhebung, Rekonstruktion,
Begutachtung. Springer Medizin Verlag, Berlin, S. 495-537.
PeqLab Biotechnologie GmbH: E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit - Arbeitsanleitung.
Erlangen.
Petju M, Suteerayongprasert A, Thongpud R, Hassiri K (2007) Importance of dental
records for victim identification following the Indian Ocean tsunami disaster in
Thailand. Public Health 121(4): 251-257.
Pfeiffer H Hühne J, Seitz B, Brinkmann B (1999) Influence of soil storage and
exposure period on DNA recovery from teeth. Int. J. Legal Med. 112(2): 142-144.
Ritz-Timme S, Cattaneo C, Collins MJ, Waite ER, Schütz HW, Kaatsch HJ, Borrman
HI (2000) Age estimation: the state of the art in relation to the specific demands of
forensic practise. Int. J. Legal Med. 113(3): 129-136.
Rötzscher K (2000) Forensische Zahnmedizin: Forensische Odonto-Stomatologie.
Springer, Berlin.
Rötzscher K (2003) Individuelle Merkmale. In: Madea B, Brinkmann B (Hrsg.)
Handbuch gerichtliche Medizin 2. Springer-Verlag, Berlin, S. 1590-1598.
Satzung des Arbeitskreises Forensische Odonto-Stomatologie vom 14.05.1996;
www.akfos.org/satzung.html (aufgerufen am 23.03.2007).
Schuller-Gotzburg P, Suchanek J (2006) Forensic odontologists successfully identify
tsunami victims in Phuket, Thailand. Forensic Sci. Int. [Epub ahead of print;
www.pubmed.com].
Schmerer W, Hummel S, Herrmann B (1999) Optimized DNA extraction to improve
reproducibility of STR genotyping with highly degraded DNA as target.
Electrophoresis 20(8): 1712-1716.
Sicher H, Tandler J (1928) Anatomie für Zahnärzte. Verlag von Julius Springer, Berlin.
Siegmund-Schultze N (2003) Seit 100 Jahren arbeiten deutsche Polizisten mit dem
Fingerabdruck. Ärzte Zeitung, 14.05.2003.
Sutlovic D, Gojanovic MD, Andelinovic S, Gugic D, Primorac D (2005) Taq
polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by
humic acid. Croat. Med. J. 46(4): 556-562.
Tan PH (2005) The killing field of Khao Lak: forensic odontology in Thailand tsunami
victim identification. Singapore Dent. J. 27(1): 41-50.
Tsuchimoochi T, Iwasa M, Maeno Y, Koyama H, Inoue H, Isobe I, Matoba R, Yokoi
M, Nagao M (2002) Chelating resin-based extraction of DNA from dental pulp and
sex determination from incinerated teeth with Y-chromosomal alphoid repeat and
short tandem repeats. Am. J. Forensic Med. Pathol. 23(3): 268-271.
Urquhart A, Oldroyd NJ, Kimpton CP, Gill P (1995) Highly discriminating heptaplex
short tandem repeat PCR system for forensic identification. Biotechniques 18: 116-
121.
Wallin JM, Buoncristiani MR, Lazaruk KD, Fildes N, Holt CL, Walsh PS (1998)
TWGDAM validation of the AmpFlSTRTM blue PCR Amplification Kit for forensic
casework analysis. J. Forensic Sci. 43(4): 854-870.
Walsh PS, Fildes NJ, Reynolds R (1996) Sequence analysis and characterization of
stutter products at the tetranucleoide repeat locus vWA. Nucleic Acids Res. 24(14):
2807-2812.
Weber Th (2003) Memorix – Zahnmedizin. Georg Thieme Verlag, Stuttgart.
Whittacker DK, MacDonald DG (1993) Atlas der forensischen Zahnmedizin.
Deutscher Ärzte-Verlag, Köln.
Williams D, Lewis M, Franzen T, Lissett V, Adams C, Whittaker D, Tysoe C, Butler R
(2004) Sex determination by PCR analysis of DNA extracted from incinerated,
deciduous teeth. Science & justice – J. Forensic Sci. Soc. 44(2): 89-94.
Yang DY, Eng B, Saunders SR (2003) Hypersensitive PCR, ancient human mtDNA,
an contamination. Hum. Biol. 75(3): 355-364.
Yeates C, Gillings MR, Davison AD, Altavilla N, Veal DA (1997) PCR amplification of
crude microbial DNA extracted from soil. Lett. Appl. Microbiol. 25(4): 303-307.
Zeitler JP (2005) Skelette erzählen - Sonderbestattung vor der Friedhofmauer in
Katzwang. In: Stadt Nürnberg, Hochbauamt - Untere Denkmalschutzbehörde (Hrsg.)
Krieg und Frieden - Wehrbauten in und um Nürnberg. Kurzführer zum Tag des Offenen
Denkmals 2005, Nürnberg, S. 44-48.
Ziegle JS, Su Y, Kevin P, Corcoran LN Mayrand PE, Hoff LB, McBride LJ, Kronick
MN, Diehl SR (1992) Application of automated DNA sizing technology for genotyping
microsatellite loci. Genomics 14: 1026-1031.

Danksagung
Mein Dank gilt in besonderem Maß Herrn Prof. Dr. med. Dieter Patzelt für die Bereitstellung
dieser Arbeit und eines Arbeitsplatzes in den Laboratorien des Instituts für
Rechtsmedizin. Er ließ mir bei der Durchführung der Arbeiten jede nötige Hilfe
zukommen und darüber hinaus bekam ich durch ihn interessante Einblicke in die
Rechtsmedizin.
Ein großes Dankeschön gebührt auch meinem Betreuer Herrn Dr. Sven Jung, der
mir bei allen Fragen, die sich ergaben, unterstützend und beratend zur Seite stand
und mich in die Geräte und Untersuchungsmethoden unterwies.
Herrn Prof. Dr. med. dent. Dipl.-Ing. Ernst-Jürgen Richter danke ich für die Übernahme
des Korreferats.
Weiterhin danke ich Frau Hinkelmann, die ebenfalls immer ein offenes Ohr für mich
hatte und die mich in ihrem Arbeitsbereich aufnahm.
Auch bei allen anderen Mitarbeitern des Instituts möchte ich mich herzlich bedanken,
vor allem bei Herrn Dr. Etzel, der mir einige Zähne überließ, sowie bei den
Präparatoren, von denen ich Zähne aus dem Sektionsgut für diese Arbeit bekam.
Herrn Dr. Mühldorfer von der Naturhistorischen Gesellschaft Nürnberg danke ich für
die Bereitstellung mehrerer sehr alter Zähne, die eine große Bereicherung für diese
Arbeit waren.
Ein weiterer Dank gilt meinem Onkel Herrn Dr. Lothar Gebhard, der mir ebenfalls bei
der Sammlung von Zähnen für diese Arbeit half.
Als letztes möchte ich meinen Eltern danken, die es erst ermöglicht haben, dass ich
es so weit geschafft habe. Meinem Vater danke ich besonders für die Bereitstellung
der meisten Zähne und für die Vorbereitungen sämtlicher Zähne in dessen Praxis.


Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die Dissertation selbstständig angefertigt
und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt
habe.
Die Dissertation wurde weder vollständig, noch teilweise einer anderen Fakultät
vorgelegt, mit dem Ziel, einen akademischen Grad zu erwerben.
Ich habe noch nie versucht einen akademischen Grad zu erwerben, es wurde mir
auch kein solcher entzogen.
Gegen mich ist kein strafrechtliches Ermittlungsverfahren oder Disziplinarverfahren
eingeleitet.
Schnaittach, den 01.07.2009
Sebastian Gebhard

Ernährung

Achten Sie auf eine gesunde, ausgewogene Ernährung gemäß den Empfehlungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO).


Die mit Bildern vollständige Dissertation "DNA-analytische Untersuchungen an frischen und gelagerten Zähnen" ist auf dem OPUS-Server der Universität Würzburg als pdf-Datei veröffentlichet.

Oder als hier als download: